铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa, FACHB-905)，购于中国科学院水生生物研究所淡水藻库；培养基为 BG-11（自制），高温高压（121 °C，20 min）灭菌后使用；草甘膦购于安徽东至广信农化有限公司（纯度95.25%）；Nano-PS-NH₂购于Bangs Laboratories，Inc（含固率10%）；SOD试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Rnaprotect^®细菌试剂盒购于Qiagen, Hilden（德国）；柱式细菌总 RNA 抽提纯化试剂盒购于上海生物工程（中国）；Primescript^TM RT reagent kit with gDNA Eraser购于Takara（日本）；TB Green^TM Premix Ex Taq^TM II (Tli RNaseH Plus)购于Takara（日本）。

无菌操作台（SW-CJ-2FD 中国苏净安泰公司）；立式高压灭菌锅（LDZX-50KBS 中国上海申安医疗器械厂）；恒温光照培养箱（GXM 中国宁波江南仪器厂）；pH计（FE28，METTLER TOLEDO）；可见分光光度计（SP-2100 中国上海元析仪器有限公司）；分析天平（LE104E/02，METTLER TOLEDO）；超声波细胞破碎仪（92-IIN 中国宁波新芝生物科技股份有限公司）；恒温水浴锅（HH-2 中国常州博远实验分析仪器厂）；高速冷冻离心机（3K15 美国Sigma公司）；振荡器（ZD-85 中国精达公司）；酶标仪（Spark瑞士Tecan公司）；qPCR仪（Quantstudio 5美国Thermo Fisher公司）；微量紫外-可见分光光度计（Nanodrop One美国Termo Fisher公司）。

铜绿微囊藻菌株FACHB-905在高压灭菌的标准BG-11培养基中培养。将配制好的培养基的pH调节至7.2～7.4，分装到250 mL的锥形瓶中，使每瓶中包含150 mL BG-11培养基，并用高压灭菌锅在121 ℃下高压灭菌25 min。灭菌结束后，将培养基静置冷却至室温后接菌。接菌时，按照每150 mL培养基加入1.5 mL铜绿微囊藻母液进行。所有培养体系均在光照培养箱中静置培养（温度：30 °C, 光强：1 800 lux）。用分光光度计测定藻样OD₆₈₀值，以此表征铜绿微囊藻的生长情况。

分别进行草甘膦和Nano-PS-NH₂单独暴露下对铜绿微囊藻的毒性作用，以确定草甘膦和Nano-PS-NH₂对铜绿微囊藻的EC₅₀。本研究设置3个实验组，即空白对照组，草甘膦急性毒性实验组和Nano-PS-NH₂急性毒性实验组。草甘膦实验组共设置了5、10、20、30、40、50 和70 mg/L 7个浓度梯度，Nano-PS-NH₂组共设置了1、2、3、4和4.5 mg/L 5个浓度梯度，每个浓度设3个平行。

铜绿微囊藻在接种至新鲜培养基后的1.5 d，分别投加草甘膦和Nano-PS-NH₂。草甘膦被溶解在灭菌过的BG-11培养基中，Nano-PS-NH₂用灭菌后的去离子水稀释，分别制成储备液以待投加。污染物投加后摇匀，以保证污染物和藻液混合均匀。通过紫外-可见分光光度计在680 nm波长下分别测定在加药后的第0、第1和第2 d铜绿微囊藻的细胞浓度OD₆₈₀，并计算不同浓度草甘膦和Nano-PS-NH₂暴露下铜绿微囊藻的抑制率。

根据1.3实验中的结果可以得到草甘膦和Nano-PS-NH₂的EC₅₀。在复合毒性实验中，污染物的浓度设置为铜绿微囊藻生长抑制率为30%时对应的浓度。

在复合毒性实验中，共设置4个实验组，分别是空白对照组、草甘膦和Nano-PS-NH₂单独暴露组以及草甘膦和Nano-PS-NH₂复合毒性组。草甘膦和Nano-PS-NH₂单独暴露的实验组中的投加浓度分别为36.31和1.38 mg/L。在复合毒性实验组中，向体系中同时投加相应浓度的草甘膦和Nano-PS-NH₂，最终体系中草甘膦的浓度为36.31 mg/L，Nano-PS-NH₂的浓度为1.38 mg/L。污染物投加后的第0、第1和第2 d用紫外-可见分光光度计分别测定铜绿微囊藻的OD₆₈₀。计算各实验组草甘膦和Nano-PS-NH₂对铜绿微囊藻的抑制率。在污染物投加48 h后进行后续指标的测定。

细胞膜膜通透性使用SYTOX green核酸染料(Invitrogen, USA)来区别破裂的细胞和完整的细胞^[23]。SYTOX green核酸染料能渗透入细胞膜受损的细胞并与核酸结合发出强烈的荧光，特别适合革兰氏阴性菌、阳性菌及某些病毒粒子的染色。取适量藻液离心重悬至BG-11 培养基中，并向其中加入SYTOX green染料，使其在体系中的浓度为0.1 μm，并在37 ℃下孵育10 min后于470 nm激发波长和520 nm发射波长下用酶标仪进行检测。

取适量铜绿微囊藻藻液，在4 ℃条件下，10 000 r/min离心5 min。去掉上清液，重悬至定量灭菌后的去离子水中，并用液氮反复冻融3次以达到破碎细胞的目的。液氮反复冻融后的藻液在10 000 r/min下离心5 min，取上清并稀释一定倍数后用于SOD的检测。使用超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（南京建成生物工程研究所）处理上清液，并在450 nm波长下用酶标仪进行细胞内SOD的测定^[23]。

取定量藻液，在10 000 r/min下离心5 min，取上清液用于胞外的藻毒素含量。弃去剩余的上清液，胞体重悬在300 μL的去离子水中使细胞涨破，并用液氮反复冻融3次。在10 000 r/min下离心5 min，取上清液用于胞内藻毒素的测定。使用微囊藻毒素（MCs）试剂盒处理胞内和胞外的上清液，并用酶标仪在450 nm下进行测定^[24]。

取4 mL藻液于10 mL棕色离心管内，10 000 r/min, 4 °C下离心6 min，弃上清，加入90%甲醇溶液4 mL溶解沉淀并涡旋混匀，避光条件下于45 °C恒温震荡24 h，浸提后将藻样10 000 r/min离心6 min，分光光度计测上清液665 nm处吸光值^[24]。

选择编码光合作用系统的核心蛋白的基因psaB、psbD以及与催化固定CO₂相关的基因rbcL3种功能基因作为研究对象。在Nano-PS-NH₂和草甘膦投加后48 h进行取样。16s rDNA基因被选作内参基因，用于标准化定量分析功能基因的结果。使用Rnaprotect^®细菌试剂盒（Qiagen, Hilden, Germany）和柱式细菌总 RNA 抽提纯化试剂盒（上海生物工程，中国）提取总RNA。在逆转录之前，用Primescript^TM RT reagent kit with gDNA Eraser（Takara, Japan）以去除RNA中的基因组DNA，以避免基因组DNA带来的影响。通过PCR逆转录反应合成cDNA，于−80 ℃保存。扩增反应的正反引物见表1。将逆转录得到的cDNA适当稀释后用实时定量qPCR进行检测。所有样品重复做3个平行，3种功能基因的表达水平用内参基因16s rDNA表达水平标准化。测试结果使用2^−△△Ct值计算测试组相对于对照组的基因相对表达差异^[25]。

根据抑制率-浓度曲线分别求得草甘膦和Nano-PS-NH₂的EC₅₀。抑制率计算方法，见式（1）。

式（1）中，OD_空白t为计算时空白组（未投加污染物）的OD值；OD_空白0为初始时空白组的OD值；OD_实验t为计算时实验组（投加污染物）的OD值；OD_实验0为初始时实验组的OD值。

EC₅₀值定义为引起藻类最大抑制率50%时草甘膦或Nano-PS-NH₂的浓度，可通过Prism软件将抑制率（%）相对于草甘膦或Nano-PS-NH₂浓度的对数作图来拟合与计算获得其对应的EC₅₀。

显著性分析采用双尾t检验，p <0.05时被认为差异是显著，并以*（p <0.05）和**（p <0.01）表示。

根据第1和第2 d的抑制率-浓度曲线图1和图2的EC₅₀值可以得出，草甘膦在投加到体系后的第1天对铜绿微囊藻的抑制作用最强（EC₅₀越小，抑制作用越强），而Nano-PS-NH₂在投加后的第2天对铜绿微囊藻的抑制作用最强。污染物投加后的第1 天，Nano-PS-NH₂的EC₅₀为2.377 mg/L，草甘膦的EC₅₀为40.10 mg/L。污染物投加后的第2 天，Nano-PS-NH₂的EC₅₀为2.146 mg/L, 草甘膦的EC₅₀为40.52 mg/L。

在复合毒性实验中，污染物的浓度设置为铜绿微囊藻生长抑制率为30%时对应的浓度。根据急性毒性实验中的抑制率-浓度曲线可以得出草甘膦对铜绿微囊藻的生长抑制率30%时的浓度为36.31 mg/L，Nano-PS-NH₂对铜绿微囊藻的生长抑制率30%时的浓度为1.38 mg/L。

污染物投加后48 h 时，单独暴露草甘膦的实验组中草甘膦对铜绿微囊藻的生长抑制率为66.9%，单独暴露Nano-PS-NH₂的实验组抑制率为37.1%，复合毒性实验组的抑制率为71.9%。其中复合毒性实验组与草甘膦和Nano-PS-NH₂单独暴露的实验组相比，抑制率均有显著性差异（p<0.05），图3。

图3可见，草甘膦和Nano-PS-NH₂复合毒性实验组对铜绿微囊藻的生长抑制作用均高于草甘膦和Nano-PS-NH₂单独暴露下对铜绿微囊藻的抑制作用，其中草甘膦和Nano-PS-NH₂的复合毒性对铜绿微囊藻的抑制作用略高于草甘膦单独暴露下对铜绿微囊藻的抑制作用，而远高于Nano-PS-NH₂暴露下对铜绿微囊藻的抑制作用。草甘膦和Nano-PS-NH₂联合暴露下对铜绿微囊藻的生长抑制作用最强，由于复合毒性小于二者毒性之和，故而其复合毒性作用体现为拮抗作用，在实际环境中两者的相互作用可能造成更严重的危害。

在污染物投加48 h后，测定草甘膦和Nano-PS-NH₂对膜通透性造成的影响，见图4。

图4中无论是草甘膦和Nano-PS-NH₂单独暴露还是联合暴露下的实验组，与空白对照组相比都对细胞膜造成了更强的损伤，导致膜通透性增强（p<0.05）。但复合毒性实验组与单独暴露实验组之间对膜通透性的影响均没有显著性差异（p>0.05）。

这一结果说明了Nano-PS-NH₂和草甘膦都通过破坏细胞膜对铜绿微囊藻产生毒性，抑制了铜绿微囊藻的生长。

在污染物投加48 h后，测定空白组和实验组细胞内SOD的含量水平，见图5。

空白对照组细胞内SOD的含量为0.54 U/10^⁶ cells,草甘膦单独暴露组、Nano-PS-NH₂单独暴露组、复合毒性实验组细胞内SOD含量分别为0.70、0.57和0.66 U/10^⁶ cells。所有实验组较空白对照组SOD的含量均有所升高。其中草甘膦单独暴露下和草甘膦与纳塑料联合暴露下细胞内SOD的含量水平与空白对照组之间有显著性差异（p<0.05）。

文献[26]报道，微米或纳米级的银颗粒或碳纳米管可以使藻类的活性氧（ROS）水平升高，导致藻类氧化应激，从而抑制藻类生长。也有研究发现，在加入化感物质后，铜绿微囊藻的SOD活力在12 h时稍升高，但随着时间的推迟SOD的活力开始显著降低^[27]，这种变化与观察的时间及细胞初期的应激反应有关^[28]。

污染物投加48 h后，测定空白对照组和实验组胞外（a）、胞内（b）和总藻毒素（c）的释放水平以及释放率（d），见图6。

空白对照组、草甘膦单独暴露组、Nano-PS-NH₂单独暴露组和复合毒性实验组中铜绿微囊藻细胞外藻毒素释放水平分别为1.95、4.03、2.92 和4.79 pg/cell；胞内藻毒素的含量分别为0.99、1.05、1.01和1.22 pg/cell；总藻毒素释放量分别为2.99、5.08、3.93和6.03 pg/cell；胞外藻毒素释放率分别为66.39%、79.29%、74.28%和79.83%。

与空白对照组相比，所有实验组的胞外藻毒素释放量都明显升高（p<0.05）。草甘膦和Nano-PS-NH₂联合暴露实验组比单独暴露2种污染物胞外藻毒素的含量显著升高（p<0.05）。而对于胞内藻毒素的含量，单独暴露草甘膦和Nano-PS-NH₂的实验组与空白组之间没有显著性差异（p>0.05），草甘膦和Nano-PS-NH₂联合暴露的实验组与空白对照组相比，胞内藻毒素含量明显升高（p<0.05），且均明显高于单独暴露2种污染物的实验组胞内藻毒素的含量（p<0.05）。所有实验组的胞内和胞外藻毒素的释放总量均较空白对照组明显提高（p<0.05），草甘膦和Nano-PS-NH₂联合暴露实验组藻毒素总释放量高于单独暴露草甘膦和Nano-PS-NH₂时藻毒素的释放总量，且有显著性差异（p<0.05）。对于胞外藻毒素释放率，草甘膦和Nano-PS-NH₂的暴露下，胞外藻毒素的释放率都显著上升（p<0.05）。草甘膦和Nano-PS-NH₂联合暴露下，胞外藻毒素的释放率比单独暴露草甘膦，略微升高（P>0.05），比单独暴露Nano-PS-NH₂下显著升高（P<0.05）。

综上，Nano-PS-NH₂和草甘膦对铜绿微囊藻藻毒素的释放量有一定促进作用，其中草甘膦和Nano-PS-NH₂联合暴露对藻毒素的释放促进作用最强。

微囊藻毒素对脊椎动物有很强的肝脏毒性^[29]，并能在生物体内积累沿着食物链向更高级的消费者传递^[30]，引起动物和人类的中毒事件^[31]。2种污染物单独暴露和联合暴露下，铜绿微囊藻藻毒素的释放量均有明显提升，铜绿微囊藻的藻毒素释放水平在草甘膦和Nano-PS-NH₂的复合毒性作用下相比草甘膦和Nano-PS-NH₂单独作用有了更显著的升高。这说明草甘膦和Nano-PS-NH₂的复合毒性作用可能对环境造成更严重的藻毒素污染。

在污染物投加48 h后，测定草甘膦和Nano-PS-NH₂对叶绿素a含量的影响，见图7。

空白对照组、草甘膦单独暴露组、Nano-PS-NH₂单独暴露组、联合暴露草甘膦和Nano-PS-NH₂实验组中叶绿素的含量分别为0.38、0.18、0.26和0.16 μg/L。所有实验组的叶绿素a含量均明显低于空白对照组的叶绿素a含量（p<0.05），且草甘膦和Nano-PS-NH₂联合暴露组叶绿素a的含量明显低于草甘膦和Nano-PS-NH₂单独暴露下的叶绿素a含量（p<0.05）。

光合作用是藻类进行生物质合成和产能的基础，BHATTACHARYA et al^[32]经过对海洋中的绿藻的研究发现，表面带电的Nano-PS-NH₂微粒可以在绿藻表面聚集并影响藻类的光合作用^[33]。还有研究结果表明，酰胺类除草剂丁草胺可以作为电子传递的抑制剂抑制光合作用中的希尔反应和植物的呼吸作用^[32]。对于藻类而言，纳塑料已经被证明可以减少二氧化碳的吸收并提高活性氧(ROS)的含量水平，Nano-PS-NH₂还会降低藻类的种群增长和叶绿素浓度^[34]。当铜绿微囊藻暴露在氨基修饰的聚苯乙烯Nano-PS-NH₂中时，Nano-PS-NH₂颗粒可以进入细胞并导致溶酶体损伤，细胞溶胶中的溶酶体内含物被释放出来，进而导致细胞的凋亡^[35]。

一些研究表明，Nano-PS-NH₂还会影响调控细胞氧化应激过程的基因的表达，Nano-PS-NH₂在人脑星形细胞瘤1321N1细胞S39中激活cas3和cas7^[36]。

在草甘膦和Nano-PS-NH₂不同暴露情况下，测定了对光合系统PSⅠ和PSⅡ反应中心蛋白编码基因（psaB和psbD）、催化固定CO₂相关的基因rbcL的相对表达量产生的影响，见图8。

在草甘膦单独暴露下，铜绿微囊藻光合作用相关蛋白的编码基因psaB的表达量显著下降（P<0.05），光合作用相关蛋白的编码基因psbD和下游催化固定CO₂相关的基因rbcL的表达量未受其干扰。Nano-PS-NH₂单独暴露48 h之后，基因psaB和rbcL的表达量显著下降（P<0.05）。在草甘膦和Nano-PS-NH₂联合暴露实验中，基因psaB、psbD和rbcL的表达量显著上升（p<0.05），其相对表达丰度分别为2.055、2.309和2.280。这可能是因为在草甘膦和Nano-PS-NH₂的联合暴露下，由于污染物对铜绿微囊藻的强烈胁迫作用，光合作用系统产生了应激反应，psaB、psbD和rbcL基因的上调促进了生物质的合成以抵御外界污染物对藻细胞的刺激。

陈诗^[30]的研究表明psbA和rbcL表达水平与阿莫西林的暴露浓度成正相关关系，psbA表达上调可促进D1蛋白的合成，加速电子传递，从而导致rbcL表达的上调。一些研究还表明，Nano-PS-NH₂颗粒会对参与细胞应激反应相关的基因的表达产生影响，如PS-COOH会促进Abcb1基因的表达水平上调，Nano-PS-NH₂会诱导基因cas8表达水平的上调，这些基因表达量的变化与细胞凋亡的机理息息相关^[37]。

草甘膦和Nano-PS-NH₂联合暴露下对铜绿微囊藻的抑制作用最强，且草甘膦和Nano-PS-NH₂对铜绿微囊藻的毒性作用体现为拮抗作用。草甘膦和Nano-PS-NH₂单独暴露、复合作用下，均可对细胞膜造成损伤、降低叶绿素a含量，这表明草甘膦和Nano-PS-NH₂可能通过抑制铜绿微囊藻的光合作用从而抑制铜绿微囊藻的生长。此外，草甘膦和Nano-PS-NH₂能够激活铜绿微囊藻的氧化应激反应，提高细胞的SOD水平；草甘膦和Nano-PS-NH₂均可以促进铜绿微囊藻藻毒素的释放，草甘膦和Nano-PS-NH₂联合暴露时藻毒素的释放量最高。

Nano-PS-NH₂和草甘膦单独暴露下，光合作用核心蛋白编码基因psaB和psbD、催化固定CO₂的相关基因rbcL的表达量较空白对照组基本都有所下调；草甘膦和Nano-PS-NH₂联合暴露下，光合作用核心蛋白编码基因psaB和psbD、催化固定CO₂的相关基因rbcL的表达量较空白对照组均显著大幅度上调。这可能是因为铜绿微囊藻通过上调光合作用相关基因的表达保护藻细胞免受草甘膦和Nano-PS-NH₂的过度损伤。