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农药在农产品生产，以及林业、草原和卫生害虫防控等方面发挥着重要作用。根据中国农药工业协会数据显示，截至2019年底，我国农药生产企业约1 800家，农药产量151.6×104 t，其中杀虫剂农药占比42.2%，而杀虫剂75%以上为有机磷类农药 (organophosphorus pesticides, OPPs) 。OPPs多为油状液体、微溶于水、难以自然降解，且50%以上OPPs为高毒品种，对人体具有不同程度的致癌性[1]。在农药开发和生产等活动过程中如发生泄漏，会对土壤和地下水造成长期、潜在的危害。当前甲胺磷、对硫磷等毒性较高的OPPs已被农业农村部列入禁限农药[2-3]。
近年来，OPPs在流域水体、土壤、生物体等环境介质中均有不同程度检出[4-5]，因其在环境中的持久性、生物累积性及毒性，具有较强生态风险。研究证实OPPs可能会导致神经发育障碍、生殖功能降低以及胎儿出生体重降低等人体危害[6] 。
目前，有关OPPs的研究多集中在表层土壤，对地层剖面污染分布及空间污染羽研究相对较少 [7-13]。不同剖面地层岩性存在不均质性，对OPPs污染物的缓冲、净化作用存在差异。表层土壤岩性单一，不能准确刻画污染物在地层剖面的空间分布特征，影响后续风险评估及治理修复，导致污染治理不完全或过度治理。
本研究以农药生产场地4种OPPs为目标污染物，按照污染质量分数分类，将污染羽划分为质量分数高值和质量分数低值，以确定污染源位置。采用三维空间插值方法，将OPPs污染羽按地层岩性划分，分析不同岩性中OPPs的分布及扩散规律，以为污染源识别和修复治理提供依据。
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研究地块为我国第一家开发和生产OPPs的重点企业，占地32×104 m2，有50多年的农药生产历史。年生产能力2×104 t，产品为甲拌磷、对硫磷、特丁硫磷、辛硫磷和杀螟硫磷等。由于老工业区改造原因，2010年该企业停产搬迁。经现场勘探，地块局部区域土壤有明显污染痕迹，并伴随刺激性气味。
根据地质勘探结果，构建研究区地层概念模型 (图1) ，将地层按岩性划分[14-15]，地块最大勘探深度范围内 (30 m) 地层结构为杂填土层 (0~1.39 m) 、粉土层① (1.39~2 m) 、粉质黏土层① (2~6.12 m) 、粉土层② (6.12~6.8 m) 、粉质黏土层② (6.8~8.1 m) 、粉土层③ (8.1~11 m) 和粉质黏土层③ (>11 m) 共7层。地下水水位埋深约1.0 m，含水层厚度约9 m，分布在以黏性土为主的隔水顶板 (11~12 m) 以上，流向主要为自西北向东南，受大气降水而波动。各土层相关特征参数见表1。
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如图2所示，依据国家标准《建设用地土壤污染状况调查技术导则》 (HJ25.1-2019) [16]，结合生产功能区分布，采用系统布点法，对生产区等潜在污染区加密布设采样点，采样单元面积不大于1 600 m2 (40 m×40 m网格) 。土壤样品按岩性进行采集，同一土层厚度超过3 m时，每2~3 m采集1个样品，相同岩性的至少1个样品。现场共布设土壤采样点202个钻孔，钻孔深度22 m，采集土壤样品2 175个。
采用Geoprobe直推式方式进行岩心采样，土壤样品用250 ml广口玻璃瓶和聚四氟乙烯密封垫的瓶盖完成收集与密封，所有样品采集完成后置于低温保温箱 (4 ℃) 内保存，并送至有检验检测资质的实验室，检测指标涵盖4种OPPs。土壤中OPPs的测定方法及质量控制参考USEPA 8270D-2014 [17]。
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采用Excel和ArcGIS10.2软件进行数据处理与图件绘制，利用克里金空间插值方法对4种OPPs质量分数进行插值分析，使用EVS-Pro (Version 9.93) 软件绘制OPPs质量分数空间分布。
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4种OPPs污染物性质和质量分数的统计数据见表2和表3。甲拌磷、乙硫磷、对硫磷、特丁硫磷质量分数最高分别为25 300、8 873、193 000、563 mg·kg−1，平均值分别为697、356、19 102、63 mg·kg−1。根据《EPA 区域筛选值》 (RSL-2017) [18]中标准质量分数，4种OPPs质量分数最高超标100倍以上，平均质量分数超标10倍以上，表明土壤中OPPs污染严重。研究表明，一些农药厂遗留搬迁场地及周边土壤中农药类物质质量分数较高，主要是农药产品生产及其化学废物的堆积造成的污染残留[19]。农药在环境中的降解、迁移、转化由其理化性质决定，其中影响最大的是农药的蒸汽压、水溶解度、分配系数和农药在环境中的降解速率。蒸汽压与水溶解度是决定农药分配系数的主要参数，分配系数则影响场地生物富集性，分配系数大的农药易透过皮肤进入人畜体内[20]。由表2可知，4种OPPs均具有较大的分配系数值 (大于10) ，极易在土壤中吸附。特丁硫磷在土壤中质量分数最低，这可能与蒸气压有关，蒸气压越高，挥发性越强。特丁硫磷蒸气压最高为3.95 Pa，其他3种OPPs蒸气压均小于1 Pa，表明特丁硫磷挥发性最强，易从土壤表面向大气中扩散。
本研究结果发现4种OPPs中超标率最高为甲拌磷 (26.2%) ，其次为乙硫磷 (16.8%) 、特丁硫磷 (15.4%) 和对硫磷 (5.5%) 。这与张春玲等[19]研究结果一致，该研究中，甲拌磷属于国内土壤中普遍检出的高毒性OPPs，平均检出率为13.7%，质量分数在0~0.45 mg·kg−1之间，因其水溶解性和蒸气压接近OPPs类物质的平均值，被普遍认为是OPPs的代表物质[21]。本场地土壤中甲拌磷质量分数及超标率均高于国内普遍水平，表明土壤中OPPs污染严重，对人体健康和环境具有较强潜在风险和危害，应作为特征污染物从环境介质中去除[2]。
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按《EPA 区域筛选值》 (RSL-2017) [18]标准质量分数值将4种OPPs划分为4个梯度，即不超标0~1倍、超标1~10倍、超标10~100倍、超标>100倍。由图3可知，场地土壤中4种OPPs质量分数局部均超标10倍以上，其中甲拌磷、乙硫磷、对硫磷、特丁硫磷质量分数分别超过130、320、3 800、20 mg·kg−1。质量分数高值 (超标>10倍) 区重点分布在生产车间、包装贮存车间及污水处理车间等生产区域。OPPs在生产区域的质量分数是其他区域的10~170倍。污染可能来源于生产罐体、各类水池、管线等，这些装置内溶剂通过污水管道泄露，污水管线埋深多大于2 m，受长期地质作用及腐蚀等影响导致装置下部土壤更易遭受污染，而降雨淋滤作用使污染多限定在污染源周边[22]。4种OPPs污染分布规律相似，由污染源向周围扩散。该结果与刘艳茹等[23]在某在产农药厂土壤污染调查结果一致，即农药污染以原生产车间为中心向周围扩散。
4种OPPs的空间分布特征一致，即质量分数高值区域出现在二、三车间和污水处理车间附近，污染羽呈现西北-东南方向分布，与地下水流方向一致。根据周艳等[24]对某农药污染场地4年的监测可知，污染物随着地下水流向可能发生稀释扩散作用，地下水中的氧化还原电位会加速污染物自然衰减，但污染物质量分数较高时，衰减作用受到抑制。本研究区地下水上游 (二、三车间) 甲拌磷、乙硫磷、对硫磷、特丁硫磷质量分数最高分别为11 600、1 500、193 000、563 mg·kg−1，下游 (污水处理车间) 质量分数最高分别为25 300、8 873、50 200、533 mg·kg−1；同种OPPs上下游污染质量分数降低趋势不明显，由此推断由于OPPs污染质量分数较高，地下水对污染物的迁移及衰减作用较小。4种OPPs污染面积按大小排序为甲拌磷>特丁硫磷>乙硫磷>对硫磷，表明甲拌磷在土壤中迁移能力更强。
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OPPs作为酯类化合物，具有疏水性，容易被土壤吸附和结合，在土层中富集[25-26]。由图4可知，本研究区4 种OPPs质量分数均随深度增加呈先减小后增加再减少的趋势。甲拌磷、乙硫磷、对硫磷、特丁硫磷质量分数最高值位于杂填土层 (0~1.39 m) 和粉质黏土层③ (>11 m) 中，这可能与地层渗透系数的大小有关。本研究区土层垂向及水平渗透系数为10−6~10−8 cm·s−1，其垂向分布表现为随深度的增加先降低后升高再降低的趋势，该结果与OPPs质量分数垂向分布规律一致。
污染物在环境介质中的迁移规律与污染物种类及降解速率有关[27]，王迎菲等[28]研究发现，环境中残余农药在土壤中降解速率随种类及性质而变化。本研究区OPPs垂向分布以迁移深度大小顺序为乙硫磷 (17.9 m) >甲拌磷 (17.6 m) >特丁硫磷 (15.7 m) >对硫磷 (10.8 m) 。根据胡枭等[29]实验证明，对硫磷在氧气不足时可快速分解，甲拌磷、特丁硫磷在好氧条件下可发生氧化反应。本研究区土层孔隙比约0.75~1.06，结构密实，透气性差，近似厌氧条件，对硫磷可能发生降解作用，因此垂向迁移深度小于其他3种OPPs。瞿程凯等[30]在分析土壤-水环境系统中农药迁移特征时发现，污染物可沿着优势通道快速迁移至土层深处，但在孔隙较小的土壤中，污染物被吸附在土壤中或被土壤基质所约束，迁移能力明显降低。本研究区土层分布以粉质黏土层为主，粒径较小，连通性差，具有良好的持水性能，这可能是造成OPPs在不同深度黏土层富集的主要原因。
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由图5可知，OPPs在地层的垂向分布具有连续性，污染羽以体积大小排序，表现为甲拌磷>特丁硫磷>乙硫磷>对硫磷。4种OPPs的质量分数在场地土壤中均存在高值 (超标>10倍) 和低值 (超标≤10倍) ，整体表现为局部质量分数较高，逐渐向四周扩散的趋势。该结果与肖丽珍等[31]的研究一致，即污染物空间分布特征表现为以质量分数高值区为中心向四周递减。
OPPs在垂向迁移的过程中，若遇到致密且连续的黏性土，可能会横向迁移[32]。分析OPPs在不同深度的水平污染分布可知，甲拌磷、乙硫磷、对硫磷、特丁硫磷局部污染较重，质量分数高值区可能为污染源排放区。本研究区OPPs的质量分数高值与低值分布范围在表层 (0~3 m) 与深层 (>3 m) 土壤中相似，表明经长时间渗透和淋滤作用，OPPs不断向深层迁移。这与刘敏等[33]的研究结果一致，该研究在分析农药生产企业场地污染物插值结果时得出，地下5 m处土样中污染物质量分数空间分布与表层基本一致，且质量分数高值处与表层高值处相对应。
将OPPs插值结果按地层概念模型划分为7层，使污染羽与地层岩性垂向分布相对应。分析污染插值结果可知，甲拌磷、乙硫磷、对硫磷、特丁硫磷在第1层至第7层土样中均有检出，表明4种OPPs在垂向上的迁移能力均较强。OPPs质量分数高值 (超标>10倍) 在第1~4层随深度增加变化不大，在第5~7层中随深度增加逐渐降低，而OPPs质量分数低值 (超标≤10倍) 在第1~7层中随深度增加变化不大。其可能的原因是OPPs质量分数高值超标孔位距离污染源较近，浅层土壤受污染垂向渗透和淋滤作用时间较长所致。在取样深度大于10 m的土壤样品中，甲拌磷、乙硫磷、对硫磷、特丁硫磷质量分数高值 (超标>10倍) 分别为4 700、2 774、272、84.2 mg·kg−1，高于《EPA 区域筛选值》 (RSL-2017) [18]，但与本场地土壤中OPPs质量分数最高值对比，降低了68.74%~99.86%，说明OPPs在土层阻隔和吸附作用下发生部分衰减，这与张涛等[26]的研究结果一致。此外，以往研究结果[34]同样表明，农药类污染物在土壤中的半衰期长达20~30年，具有环境持久性与难降解特征，仅依靠自然衰减短时间内无法使OPPs恢复至安全水平。
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1) 该农药生产地块土壤中存在4种OPPs，即甲拌磷、乙硫磷、对硫磷、特丁硫磷，平均质量分数分别为697、356、19 102、63 mg·kg−1，高于国内农药普遍检出水平。OPPs污染主要集中在生产车间及污水处理车间，表现为以原生产车间为中心向周围扩散。
2) OPPs以污染面积为大小顺序为甲拌磷>特丁硫磷>乙硫磷>对硫磷，迁移能力以深度大小顺序为乙硫磷 (17.9 m) >甲拌磷 (17.6 m) >特丁硫磷 (15.7 m) >对硫磷 (10.8 m) ，表明甲拌磷在土壤中迁移能力更强。
3) 同种OPPs在表层 (0~3 m) 与深层 (>3 m) 土壤中污染分布规律类似，即甲拌磷、乙硫磷、对硫磷、特丁硫磷污染范围随深度增加变化不大。4种OPPs质量分数高值 (超标>10倍) 在土层的阻隔和吸附作用下逐渐降低，但OPPs质量分数低值 (超标≤10倍) 变化不明显。
有机磷农药生产场地污染分布特征分析
Analysis on Distribution Characteristics of Soil Organophosphorus Pesticides (OPPs) in The Production Site
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摘要: 针对有机磷农药 (OPPs) 生产场地存在污染的环境问题，以某农药生产企业污染地块为研究对象，分析了OPPs在土层中的空间分布和扩散规律。通过三维空间插值表征4种OPPs (甲拌磷、乙硫磷、对硫磷、特丁硫磷) 的污染分布。结果表明，土壤中甲拌磷、乙硫磷、对硫磷、特丁硫磷平均质量分数分别为697、356、19 102、63 mg·kg−1。根据《EPA 区域筛选值》 (RSL-2017) 标准，4种OPPs质量分数均超标10倍以上。随着深度增加，4种OPPs呈现为先减小后增加再减少的趋势，与地层渗透系数变化规律一致。根据插值结果，污染羽面积大小排序为甲拌磷>特丁硫磷>乙硫磷>对硫磷，说明甲拌磷在土壤中的迁移能力最强。同一种OPPs质量分数在表层 (0~3 m) 与深层 (>3 m) 土壤中分布规律相似，局部出现质量分数高值 (超标>10倍) 。OPPs质量分数高值在土层阻隔和吸附作用下出现降低趋势。本研究结果可为农药污染地块调查及修复工程提供参考。Abstract: Aiming at the environmental problem of organophosphorus pesticides (Opps) in the production site, the spatial distribution and diffusion of Opps in the soil layer were analyzed by taking the contaminated site of a pesticide production enterprise as the research object. In this study, the three-dimensional spatial interpolation was used to characterize the pollution distribution of four Opps (phorate, ethiophos, parathion and terbuthion) in soil of a pesticide production site. The average concentrations of phorate, ethiophos, parathion and terbuthion were 697, 356, 19 102 and 63 mg·kg−1, respectively. According to the standard content of EPA Regional Screening Value (RSL-2017), the concentrations of four Opps exceeded the standard values by a factor of > 10. As depth increases, four Opps exhibited a similar trend which first increased, and then decreased and again increased. Such variation was consistent with the permeability coefficient. The rank of pollution plume area was phorate > terbuthion > ethiophos > parathion, which indicated that the migration ability of phorate was the strongest in soil. The distribution trend of Opps concentration was similar in both surface layer (0~3 m) and deep layer (> 3 m) of soil with local high-concentration values (more than 10 times above the standard values). The concentration of high-concentrations Opps decreased under the action of soil barrier and adsorption. Results from the study could provide a scientific basic for the remediation of pesticides in the contaminated sites.
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双酚A (bisphenol A, BPA)是合成塑料的原料，可以制成各种常见的塑料品，如水瓶、运动器材、医疗器械等。不合理的使用使其广泛存在于工业废水、地表水、地下水甚至饮用水中[1]。双酚A具有神经毒性、免疫毒性、致癌性和致畸性[2]，也可影响人和动物的内分泌系统，导致雄性动物雌性化和生殖能力下降。因此，去除双酚A对生态环境和人类健康有重要意义。
目前，双酚A的脱除方法有物理法、化学法、生物法等。其中，酶法处理因其速度快、选择性强而得到了广泛的应用[3]。辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)是一种具有铁卟啉活性中心的血红素蛋白，能在过氧化氢的存在下氧化降解双酚A。当底物分子被氧化成自由基后，可以重新排列、偶联形成相应的聚合物以及其他化合物[4]，这些化合物无毒，易于从水中去除。然而，游离的HRP存在着热稳定性和存储稳定性差、成本高、难回收且不能重复利用的缺点。一种有效的解决方法是将酶固定在特定载体上[3]，可显著改善其稳定性，实现其长期使用。
金属有机骨架(metal organic frameworks, MOFs)是由金属离子和有机配体通过络合作用自组装形成的具有周期性网络结构的晶态多孔材料，既结合了无机材料的稳定性，又结合了有机材料的多样可修饰性。MOFs材料由于具有较大的比表面积、可调节的多孔形态和良好的生物相容性，在生物传感、催化、药物缓释等领域取得了重大突破[5]。已有研究证明金属有机骨架可以用于酶的共价固定化。SHIN等[6]通过二环己基碳二亚胺使胰蛋白酶接枝到MIL-88B-NH2(Cr)上，并用于牛血清蛋白降解。DOHERTY等[7]利用戊二醛将β-葡萄糖苷酶固定在NH2-MIL-53(A1)上用于催化水解D-水杨苷转化成葡萄糖。据报道，MIL-88B(Fe)是一种高稳定性、高生物相容性的铁基MOF[8]。基于此，本研究中，利用MIL-88B(Fe)富含官能团的优势，采用EDC/NHS作为交联剂，将HRP负载于MIL-88B(Fe)上，并考察了固定化酶降解双酚A的影响因素，探究了固定化酶的稳定性和可重复使用性。
1. 材料与方法
1.1 实验原料
HRP(>160 U·mg−1，冻干粉，RZ>2)，双酚A(BPA)，三氯化铁(FeCl3·6H2O)，对苯二甲酸(H2BDC)，1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，N, N-二甲基甲酰胺(DMF)，乙醇(C2H5OH)和苯酚购自阿拉丁试剂有限公司(中国上海)。4-氨基安替比林(4-AAP)、过氧化氢(H2O2，质量分数为30%)、聚乙二醇(PEG)购自国药化学试剂有限公司(中国上海)。
1.2 表征
采用X射线衍射仪(XRD，Bruker D8)对MIL-88B(Fe)和MIL-88B(Fe)/HRP材料进行表征。采用傅里叶变换红外光谱仪(FTIR，Thermo-Nicole，美国)对材料表面的官能团进行测定。采用扫描电子显微镜(SEM, Carl Zeiss显微镜，德国)观察样品的形貌。采用热重分析仪(TGA，EXSTAR，日本)测定热稳定性。
1.3 MIL-88B(Fe)的制备
MIL-88B(Fe)材料根据文献[9]报道的方法进行制备：将0.756 g (2.770 mmol)三氯化铁和0.231 g (1.385 mmol)对苯二甲酸溶解在60 mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中。在室温下搅拌30 min后，将溶液转移到高压反应釜中，置于150 ℃的烘箱中恒温加热反应2 h。反应结束后自然冷却至室温，将所得固体用离心分离并用乙醇洗涤数次，最后在真空干燥箱中60 ℃干燥12 h后，得到MIL-88B(Fe)粉末材料。
1.4 MIL-88B(Fe)/HRP的制备
将10 mg MIL-88B(Fe)材料、40 mg的EDC和20 mg的NHS加入到10 mL质量浓度为0.04 mg·mL−1的酶溶液中，在室温下搅拌4 h，反应结束后，所得混合物用去离子水清洗以去除未固定的游离酶。收集含残留酶的上清液，采用Bradford法，用紫外分光光度计在波长为595 nm处测定蛋白含量[10]，以计算得出酶的负载量。将MIL-88B(Fe)/HRP分散在去离子水中，并在4 ℃的冰箱中保存。
1.5 酶活性的测定
以苯酚、4-AAP和H2O2为底物，采用比色法测定酶的活性[11]。通过记录在510 nm处的吸光度变化来监测催化反应。1个活性单位被定义为在上述条件下每分钟水解1×10−6 mol的H2O2所需HRP的量。
1.6 降解实验
降解实验在锥形瓶(150 mL)中进行。试剂按如下顺序添加：双酚A (10~100 mg·L−1)溶液、2.5 mL磷酸盐缓冲液(pH=7, 200 mmol·L−1)、1 mg·mL−1 PEG (0.1~0.8 mL)、H2O2和MIL-88B(Fe)/HRP材料(0.02~0.10 g·L−1)。将混合溶液用磁力搅拌器搅拌，并在预定的时间用注射器取出上清液，用0.22 μm过滤器过滤以备后续测定。所有实验均进行3次，数据取平均值。
采用分光光度法(λ=510 nm)测定双酚A的质量浓度。在铁氰化钾存在下，双酚A与4-氨基安替比林在pH为10.0±0.2时反应生成橙色染料，吸光度值与双酚A的浓度成正比[3]。
1.7 回收实验
每次反应结束后，用离心分离法分离出所使用的MIL-88B(Fe)/HRP，并用去离子水清洗，以去除物料内残留的反应溶液。之后，在上述实验条件下，催化剂在新的反应介质中重复使用。每一轮降解在25 ℃进行，并测定保留活性。所有实验均进行3次，取平均值。
2. 结果与讨论
2.1 材料表征
1) SEM分析。由图1(a)可以看出，MIL-88(Fe)的形态为纺锤状。EDS能谱分析表明了MIL-88B(Fe)中Fe、C、O元素的存在和均匀分布。通过EDC/NHS将HRP共价固定在MIL-88(Fe)上后，Fe-MOF的形态保持不变(图1(b))。
图 1 MIL-88(Fe)和MIL-88(Fe)/HRP的SEM图谱Figure 1. SEM images of (a) MIL-88(Fe), (b) MIL-88(Fe)/HRP2) XRD分析。合成的MIL-88B(Fe)的XRD图谱如图2所示。衍射峰与之前报道MIL-88B(Fe)的相应峰[002]、[101]、[103]、[202]和[211]匹配良好[12]，并且衍射峰强度高，说明MIL-88(Fe)结晶良好。MIL-88B(Fe)/HRP的特征峰与MIL-88B(Fe)基本一致，表明在HRP存在下，MIL-88B(Fe)的结构完整性和结晶形态得以保留，且结合过程中没有导致相变。峰强变弱表明酶成功负载在MIL-88B(Fe)上。
图 2 MIL-88(Fe)和MIL-88(Fe)/HRP的XRD图谱Figure 2. XRD patterns of MIL-88B(Fe) and MIL-88B(Fe)/HRP3) FTIR分析。为了进一步分析MIL-88B(Fe)样品的分子结构和官能团，对其进行了FTIR光谱表征，结果如图3所示。分别在552、1 394和1 548 cm −1处观察到MIL-88B(Fe)的特征吸收峰，这与文献[13]中报道的结果相同。在552 cm −1处的强波段为Fe—O振动峰。在1 548 cm−1和1 394 cm−1处的2个峰是羧基的不对称振动峰和对称振动峰，这证实了MIL-88B(Fe)材料中存在二羧酸配体[14]。在负载HRP后，MIL-88(Fe)出现了新的特征峰，其中1 029.93 cm−1为酰胺键的N—H弯曲振动峰，其在1 174~955 cm−1的蛋白质特征结构区域内[15]，3 700~3 000 cm−1处的特征峰为—OH和—NH基团[16]。可以看出，固定化酶材料同时具有MIL-88B(Fe)和HRP的特征吸收峰，表明MIL-88(Fe)/HRP的成功制备。
图 3 HRP、MIL-88(Fe)和MIL-88(Fe)/HRP的FTIR图谱Figure 3. FTIR spectra of HRP, MIL-88B(Fe) and MIL-88B(Fe)/HRP4) TGA分析。热重曲线(图4)表明，MIL-88B(Fe)在<350 ℃条件下具有良好的热稳定性。当温度高于350 ℃时，结构发生坍塌(急剧失重)。与MIL-88B(Fe)相比，MIL-88(Fe)/HRP的TGA曲线有2个明显的失重步骤。第1次质量损失(<100 ℃)是由于吸附水和结合水的蒸发[17]。第2次质量损失(约300 ℃)是由于MOF骨架的坍塌所致，这与MIL-88B(Fe)的变化趋势一致。当温度达到450 ℃时，固定化酶保留了29.9%的初始质量，比MIL-88B(Fe)的25.3%稍微高一点，这是由于固定化酶在热解过程中残留了一些有机物所导致的[18]。
图 4 MIL-88(Fe)和MIL-88(Fe)/HRP的TGA图谱Figure 4. TGA curves of MIL-88B(Fe) and MIL-88B(Fe)/HRP2.2 不同反应条件对BPA降解效果的影响
1)反应时间及PEG的影响。在pH为7.0的条件下，对双酚A (20 mg·L−1)进行了降解实验，以评价合成材料的催化性质。如图5所示，MIL-88(Fe)的吸附性能较差，在3 h内对双酚A的去除率仅为22.6%。在添加了过氧化氢之后，没有观察到明显的催化效果。在相同条件下，以MIL-88(Fe)/HRP为催化剂，1 h内可去除50.5%的BPA。较低的BPA降解率可能是因为催化过程中自由基和聚合产物附着在酶上，导致酶被灭活，从而使反应终止[19]。为了防止这种情况发生，一些研究者建议在反应体系中加入如聚乙二醇(PEG)等高亲水性物质。PEG可以在HRP活性中心附近形成保护层，防止反应过程中形成的游离苯氧基破坏过氧化物酶；同时，PEG对降解产物的亲和力比酶强，可以防止降解产物与酶结合[20]。在PEG的作用下，MIL-88(Fe)/HRP材料可以实现高效快速降解BPA，反应1 h后，BPA的去除率高达99.2%。与之前的相关研究相比，MIL-88(Fe)/HRP表现出优异的催化性能(表1)。
图 5 不同条件下催化材料对BPA的去除率Figure 5. Removal rate of BPA by catalytic materials under different conditions表 1 不同材料固定化酶对BPA的去除率Table 1. BPA removal rate of enzyme immobilized with different materials固定化材料 酶 催化剂投加量/(g·L−1) BPA初始浓度/(mg·L−1) 降解时间/min 去除率/% 参考文献 海绵蛋白支架 漆酶 1.00 2 1 440 >95 [21] MCMSs 漆酶 2.00 20 720 85 [22] PFM HRP 0.1425 8.7 180 93 [23] TiO2 修饰的PVDF薄膜 漆酶 <0.40 34.5 5 760 91.7 [24] NF薄膜 HRP 120 20 180 95 [25] APTES改性的TiO2纳米颗粒 漆酶 500 34.5 300 >80 [26] 磁丝纤蛋白纳米颗粒 HRP 500 50 160 80.3 [27] MCN HRP 0.5 10 50 85.7 [28] MIL-88(Fe) HRP 0.10 20 60 99.2 本研究 注：NF薄膜、APTES改性的TiO2纳米颗粒、磁丝纤蛋白纳米颗粒3种固定化材料的催化剂投加量单位为U·L−1。 | Show Table
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在催化剂投加量为0.06 g·L−1、BPA初始质量浓度为20 mg·L−1时，可以看出，在初始60 min内双酚A降解速度较快，随着时间的推移，降解速度有所减慢，在3 h基本达到降解平衡，此时双酚A的降解率为98.4%。因此，确定最佳降解反应时间为3 h。如图6所示，当PEG/BPA的质量比为0.1时，双酚A的降解率为72.7%。随着PEG用量的增加，双酚A的降解率显著提高。这是由于酶失活数量的减少，降解反应得以继续。当PEG/BPA的质量比为0.4时，双酚A降解率达到98.4%，且随着PEG的进一步添加，降解率保持不变。因此，确定最佳PEG/BPA的质量比为0.4。
2)反应温度的影响。由图7(a)可以看出，在较低温度(15~35 ℃)下，各温度下的降解率差异较小；随着反应温度提高，酶开始失活。因此，选择常温25 ℃进行后续实验。
图 7 不同降解实验条件对BPA降解效果的影响Figure 7. Effects of different degradation conditions on the degradation of BPA3)双酚A初始质量浓度的影响。如图7(b)所示，当双酚A质量浓度为10 mg·L−1时，MIL-88B(Fe)/HRP的降解效率最高；随着双酚A质量浓度由10 mg·L−1增加到100 mg·L−1，其去除率有所下降。其原因是，过多的双酚A分子聚集，导致无法接触HRP上的活性位点[29]。此外，随着双酚A质量浓度的增加，酶催化的反应速率趋于平衡，双酚A的去除率开始降低。值得注意的是，即使双酚A质量浓度为100 mg·L−1时, 仍有93.1%的BPA在4 h内被去除，这显示了MIL-88B(Fe)/HRP优秀的降解性能及其在废水处理中潜在的应用前景。
4)催化剂用量的影响。如图7(c)所示，当催化剂用量由0.02 g·L−1增加到0.10 g·L−1时，双酚A的降解率迅速提高，这是因为降解双酚A的催化活性位点有所增加。当催化剂用量为0.10 g·L−1时，1 h内可去除99.2%的BPA，但酶用量过高势必会导致成本增加。为了降低成本，控制反应速率以及方便测量，选择0.06 g·L−1作为双酚A降解的最佳催化剂剂量。
2.3 酶促反应动力学
利用米氏方程和Lineweaver-Burk图计算游离酶和固定化酶的动力学参数(米氏常数Km和最大反应速率vmax)。采用Bradford法测定得出材料固定化酶的最大负载量为38.9 mg·g−1，在保证酶的质量相同的情况下测定游离酶和固定化酶的参数。如图8(a)所示，随着底物浓度的增加，酶促反应速率先增加后趋于平稳。与游离酶相比，由于传质受限，固定化酶的反应速率较低[30]。米氏常数Km值是指酶与底物之间的亲和力，其值的大小只与酶的性质有关系，Km值越小，底物与酶的亲和力越高。如图8(b)所示，游离酶的Km为0.34 mmol·L−1，固定化酶的Km值增加到了0.47 mmol·L−1，vmax由19.23 mmol·(L·min)−1下降到14.28 mmol·(L·min)−1。这是由于共价固定改变了酶蛋白的构象，阻碍了底物与HRP活性位点的接触，使亲和力降低，最大反应速率降低。经实验测定，固定化酶可以保留游离酶活性的70.6%。
图 8 游离和固定化HRP的米氏方程图和Lineweaver-Burk图Figure 8. Michaelis-Menten plots and Lineweaver-Burk plots of free and immobilized HRP2.4 热稳定性和贮存稳定性
在工业应用中，酶的高温变性也是一个迫切需要解决的问题。固定和游离HRP的热稳定性实验，是通过在25~60 ℃内孵育1 h后，测量其残余活性来进行。由图9(a)可以看出，经过60 ℃热处理后，游离HRP的残余活性下降到55.9%，而固定化后的HRP仍保持初值的70.2%。在不同温度下，MIL-88B(Fe)/HRP的活性均高于游离酶。上述结果表明，固定化酶比游离酶具有更好的耐热性，这是由于固定化限制了酶的构象变化所致。据报道，MIL-88B(Fe)的保护作用可以抑制酶分子的展开和非特异性聚集，从而防止HRP的热变性[31]。
合成样品的贮存稳定性是评价固定化效率的重要指标。对MIL-88B(Fe)/HRP和游离HRP均通过在4 ℃去离子水中存储30 d后的残余活性进行评估(图9(b))。与所预期一样，MIL-88B(Fe)/HRP的活性下降速度明显慢于游离酶。固定化后的HRP在储藏15 d后仍保留了高达90%的初始活性，而游离的HRP的活性则降低到初始活性的64%。30 d后，游离HRP只剩下26.2%的初始活性，而合成材料的活性达到70%以上。游离HRP活性的丧失可能是由于在贮存过程中蛋白构象发生变化，活性位点不能与底物反应[32]。相反，MIL-88B(Fe)/HRP由于与酶形成强共价键，对构象变化表现出很强的抗性[33]。因此，固定化酶比游离HRP更稳定，保质期更长。上述结果表明，MIL-88B(Fe)/HRP具有良好的耐久性，在工业应用中具有较大的潜力。
2.5 固定化HRP的可重复使用性
酶固定化的主要目的之一是实现酶的重复利用。为此，研究了MIL-88B(Fe)/HRP在连续使用数次后的残留活性。如图10所示，固定化的HRP经过4次循环，残余活性仍超过80%，且第4次降解后MIL-88B(Fe)/HRP的XRD谱图仍保留了原材料的特征峰(图11)。这表明催化剂经循环使用后其结构没有发生变化，具有较高的稳定性。其原因与HRP和MIL-88B(Fe)通过EDC/NHS形成的强共价键有关，共价键的形成可增强催化剂的结构稳定性，防止酶的脱落，从而保持较高的催化活性[34]。但催化剂的相对活性随着重复使用次数的增加而降低，对于活性降低的可能原因有3点：一是由于样品量微小，部分MIL-88B(Fe)/HRP在回收过程中丢失，材料回收率仅为91.3%；二是反应过程中产物在催化剂表面的积累会阻碍HRP的活性位点，对下一个反应周期产生不利影响[35]；三是HRP在与底物反应过程中蛋白发生部分折叠或变性，导致酶失活[36]。从整体上看，固定化酶具有分离简单、稳定性好、可回收等优点，从而可大大降低酶体系的实际应用成本。
图 11 MIL-88 (Fe)/HRP降解BPA前后的XRD图谱Figure 11. XRD patterns before and after BPA degradation by MIL-88B(Fe)/HRP3. 结论
1)通过EDC/NHS共价交联体系将HRP固定化到MIL-88B(Fe)上，可得到MIL-88B(Fe)/HRP复合材料；通过一系列XRD、FTIR、SEM、TGA等手段的表征，证明了MIL-88B(Fe)的成功合成，及HRP的成功负载。
2)在PEG/BPA质量比为0.4的情况下，最终确定在pH为7、25 ℃、BPA的初始质量浓度为20 mg·L−1，固定化酶投加量为0.06 g·L−1的实验条件下，3 h内可去除98.4%的BPA。
3)在酶固定化后，酶与底物的亲和力降低。酶的活性保留了游离HRP的70.6%。
4)在固定化酶之后，MIL-88B (Fe)/HRP比游离HRP具有更好的热稳定性、贮存稳定性和可重复使用性，这可为工业应用提供潜在的可能性。
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图 1 农药污染地块不同土层岩性分布
Figure 1. Distribution of lithology in different soil layers of the pesticide-contaminated site
图 2 研究场地地层岩性柱状图及采样点分布
Figure 2. Distribution of stratum lithology and sampling sites in the research area
图 3 土壤中OPPs污染等值线分布/mg·kg-1
Figure 3. The contour map of the OPPs content in soil/mg·kg-1
图 5 场地内OPPs三维空间插值
Figure 5. Three-dimensional spatial interpolation of OPPs in the site
表 1 农药污染地块不同土层特征参数
Table 1. Characteristic parameters in different soil layers of the pesticide-contaminated site
分层 岩性 孔隙比 天然含水率/% 有机质/% 垂向渗透系数/(cm·s−1) 水平渗透系数/(cm·s−1) 第1层 填土层 1.06 36.3 6 4.98×10-7 5.57×10-7 第2层 粉土① 0.8 25.1 4.2 2.50×10-6 2.00×10-6 第3层 粉质黏土① 0.9 30.95 6.35 1.10×10-8 3.90×10-7 第4层 粉土② 0.8 25.8 2.5 6.60×10-6 8.50×10-6 第5层 粉质黏土② 1 34.8 6.6 7.20×10-8 9.50×10-8 第6层 粉土③ 0.8 26.4 3.1 4.40×10-6 1.80×10-6 第7层 粉质黏土③ 0.75 26.45 4.55 1.00×10-8 4.70×10-8
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表 2 OPPs污染物性质
Table 2. Properties of Organophosphorus Pesticide Pollutants
污染物 分子式 蒸气压/Pa 水中溶解度/ (mg·L−1) 分配系数 甲拌磷 C7H17O2PS3 0.173 50 2.33×103 乙硫磷 C9H22O4P2S4 2×10-4 2 5.57×104 对硫磷 C10H14NO5PS 2.3×10-3 11 5.38×103 特丁硫磷 C9H21O2PS3 3.95 5.07 1.57×104
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表 3 土壤中OPPs检测结果描述性统计
Table 3. Descriptive statistics of OPPs content in soil
污染物 EPA筛选值/ (mg·kg−1) 质量分数/ (mg·kg−1) 超标率/% 最大值 平均值 中值 甲拌磷 13 25 300 697 18.6 26.24 乙硫磷 32 8 873 356 5.7 16.83 对硫磷 380 193 000 19 102 0.1 5.45 特丁硫磷 2 563 63 0.1 15.35
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