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在污水生化处理单元，硝化细菌在生物脱氮中发挥着核心作用[1]，并且在整体的污水脱氮处理流程中占据着重要的地位。因此，硝化细菌的活性及其群落密度直接决定了污水处理脱氮效率的高低。然而，硝化菌是一类具有硝化作用的自养化能细菌，世代周期较长，细胞产率较低，对温度、pH、溶解氧(dissolved oxygen, DO)等环境因子敏感[2]，因此在常见的污水处理系统中，硝化菌含量较低，不利于维持高脱氮速率[3]。在垂直潜流人工湿地(vertical subsurface flow constructed wetland, VSSFCW)中反硝化过程较为彻底，但硝化过程则相反[4]，其主要限制因素是DO和硝化菌数量，同时人工湿地在实际应用中还存在启动速度慢等问题。因此研究有效的方法富集培养硝化细菌，以及探索提高人工湿地脱氮效能和启动速度的技术，对于环境保护和可持续发展具有重要意义。
目前硝化菌的富集方式主要有纯菌扩大培养法、活性污泥富集法以及载体固定法[5]。培养工艺上，主要包括序批式活性污泥法(sequencing batch reactor, SBR)[6]、厌氧好氧法(anaerobic - oxic process, A/O)[7]、周期循环活性污泥法(cyclic activated sludge system, CASS)[8]、膜生物反应器(membrane bio-reactor, MBR)[9]。在培养方式上，主要分为含有有机碳源的高氨氮培养和无机碳源的高氨氮培养。当前硝化菌的富集培养研究中表现较好的是活性污泥法配合无机碳源高氨氮培养模式，孙金凤[9]、李红岩等[10]通过小试的MBR工艺采用无机碳源培养高硝化活性的污泥，并对其进行鉴定和保存，结果表明，MBR工艺富集的硝化菌的硝化活性明显高于SBR和CASS工艺。目前在人工湿地启动过程中，通常会在人工湿地中投加外源微生物，以达到提升人工湿地在特定条件下的运行效果或者对某种污染物的去除效果，减少人工湿地启动时间的目的。杨明辉等人[11]在人工湿地中投加耐低温复合菌剂，提升了人工湿地在低温条件下对污染物的去除效果；林梓杨等人[12]在人工湿地中投加电活性菌藻膜生物膜，以微生物燃料电池的形式强化人工湿地，明显的提升了人工湿地对污染物去除效果。在实验小试条件下，徐丽娟等[13]将回流污泥训化后并用于小试人工湿地的启动，实现了20 d成功挂膜，FU等[14]采用人工湿地堵塞物进行湿地挂膜，实现了比未添加堵塞物湿地更快启动和更高的污染物去除效果，相对的全爽等[15]、岳琛等[16]采用自然挂膜方法启动人工湿地启动时间均默认为30 d，但启动时间过后，系统并未稳定。由此可以看出在人工湿地中投加外源微生物，可以有效的减少启动时间，并提升人工湿地在特定条件下的运行效果或者对某种污染物的去除效果。但迄今为止，在VFSSCW中投加高硝化活性污泥，提升VFSSCW的硝化能力并提升启动速率的研究尚未报道，提升效果及机理尚不清晰。
本研究中，我们采用MBR装置富集硝化菌，并根据硝化菌的好氧自养特性采用纯无机碳源高氨氮培养富集，以期在短时间内迅速提高活性污泥的硝化活性，然后将高硝化活性污泥和异养锰氧化菌投加进中试人工湿地，其中锰氧化菌为好氧异养型微生物，并作为参与湿地内锰循环的功能菌加入人工湿地，模拟人工湿地启动阶段多种且有竞争的功能菌加入的情况，最后在人工湿地中单独加入锰氧化菌，模拟人工湿地面对外界微生物冲击的不利条件，研究人工湿的快速启动和脱氮能力的变化，为实际人工湿地工程的快速启动和高效脱氮提供理论依据。
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硝化菌富集采用MBR工艺，MBR装置的有效容积为250 L(L=750 cm，W=620 cm，H=100 cm)，亚克力材质，内置中空纤维膜，底部安装曝气装置（图1）。中空纤维膜面积为30 m2 (南昌拓延科技有限公司HPR-MBR-1-30、改性聚偏氟乙烯、膜过滤孔径为0.1 μm、膜通量为10~20 L·(m2·h)−1、跨膜压差为2~5 kPa)。曝气通过穿孔曝气管和曝气盘等设备，以维持足够的DO浓度。MBR装置主要由进水稀释、间歇式出水控制、培养池、曝气装置和pH控制5部分模块组成。通过空气泵对培养池进行充分曝气，使反应器内DO的质量浓度大于2 mg·L−1[17]。以pH控制器作为pH的监测响应装置，协同碱泵及时补充碳酸氢钠，将培养池内的pH控制在7~8之间[18]。以液位控制器作为监测响应装置，控制出水泵将MBR装置中的水通过中空纤维膜排出，以控制水力停留时间（hydraulic retention time, HRT），并保持污泥留在培养池内。试验的活性污泥源自北京某污水处理厂MBR池污泥。
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1）装置运行工况控制。以连续式进水、间歇式出水、不排泥的培养方式对硝化菌进行快速富集培养。设置HRT为20 h，DO质量浓度大于 2 mg·L−1，pH控制在7~8。进水采用纯无机培养基，不添加任何有机碳源；通过提高进水中硫酸铵的浓度来提高系统氨氮负荷，以达到刺激硝化菌生长，获取高浓度硝化菌的目的[19]。磷酸二氢钾用于提供硝化菌生长所必需的磷元素，碳酸氢钠用于维持反应器pH和碳源补充，同时为确保硝化菌富集生长的需要，加入适当微量元素。实验整体分为3个阶段。第1阶段为适应阶段，进水氨氮质量浓度从50 mg·L−1逐渐提升到200 mg·L−1。第2阶段为快速富集阶段，进水氨氮质量浓度从200 mg·L−1逐渐提升到800 mg·L−1。第3阶段为稳定阶段。进水氨氮质量浓度维持在500~600 mg·L−1。培养液进水配置：硫酸铵质量浓度236~
7550 mg·L−1，磷酸二氢钾质量浓度87.8 mg·L−1，二水氯化钙质量浓度5 mg·L−1，六水氯化铁质量浓度2 mg·L−1，硼酸质量浓度0.072 mg·L−1，硫酸铜质量浓度0.025 mg·L−1，七水硫酸锌质量浓度0.74 mg·L−1，钼酸质量浓度 0.003 7 mg·L−1。2）硝化活性测试实验。硝化活性的测量采用氨氮的降解速率（Ammonia - Utilization Rate, AUR）来表示，根据式(1)进行计算。取培养池中的泥水混合体2 L，通过抽滤将泥水分离，将分离的污泥倒入5 L量杯中，加入2 L的蒸馏水混合均匀，在水浴加热中控制水温维持在20~25 ℃。然后，对混匀泥水进行曝气15 min，充分消耗污泥内残留的氨氮，并控制DO在2 mg·L−1以上。随后加入硫酸铵控制氨氮质量浓度在200 mg·L−1左右，以及磷酸二氢钾和微量元素。曝气2~3 min后，开始每隔30 min的采样和测试氨氮浓度。实验期间，实时监测pH，并加入碳酸氢钠维持pH在7~8。
式中：R为单位时间内氨氮的去除量(AUR)，mg·(L·h)−1(以NH4+计)；C1和C2分别为反应时间内氨氮进、出水的质量浓度，mg·L−1；t1和t2分别为反应起始和结束时间，min。
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本研究搭建了2组垂直潜流人工湿地系统，长宽高分别为50、50和80 cm，HRT设置为2 d。两组人工湿地系统从上到下分别为以下3层：1）植物生长层，种植植物为芦苇，填充火山岩和水厂熟料（无烟煤或石英沙），粒径分别为0.5~1 cm和0.2~0.4 cm，填充高度10 cm；2）功能填料层，分别为火山岩（火山岩-CW）和铁锰矿石（矿石-CW），粒径为1~2 cm，高度为50 cm；3）衬底层高度为10 cm，填充2~3 cm的砾石(图2)。人工湿地进水是模拟污水处理厂一级B标准水质的配置污水。湿地正常运行后进行功能菌接种，包含本研究富集培养的高硝化活性硝化菌，以及异养微生物锰氧化菌；接种方式为直接添加硝化污泥的泥水混合液300 mL以及含锰氧化菌的培养液200 mL，每3 d接种1次。人工湿地进水水质：COD质量浓度60 mg·L−1，氨氮质量浓度8 mg·L−1，硝酸盐氮质量浓度14 mg·L−1，总磷1 mg·L−1。
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为研究富集后污泥和人工湿地内接种后的微生物种群结构组成以及硝化菌的种类，取经过沉降后活性污泥样品以及实验结束后人工湿地上层功能填料的样品，保存在−80 ℃的冰箱里中，高通量测序委托上海美吉生物科技公司完成。
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根据相关国家标准和行业标准对常规水质指标进行测定，进出水氨氮浓度采用纳氏试剂分光光度法（HJ535-2009）进行检测；出水亚硝酸盐氮浓度采用N-1-萘基-乙二胺分光光度法（GB7493-87）进行检测；硝酸盐氮采用紫外分光光度法检测（HJ/T346-2007）进行检测；pH采用米科pH在线控制器进行监测；温度采用电子温度数显计测定；DO采用ODEON便携式水质分析进行检测。
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不同阶段MBR装置的进出水氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐的浓度、水温以及DO的变化情况如图3所示。在装置的整个运行期间，氨氮去除率稳定在90%以上，出水基本不存在亚硝酸盐氮积累问题。第2阶段进水氨氮质量浓度由200 mg·L−1提升到800 mg·L−1，DO质量浓度从初期的5 mg·L−1左右逐渐下降到1~2 mg·L−1，表明硝化菌快速富集加速了对DO的利用。在DO质量浓度下降到2 mg·L−1以下时，出水的硝酸盐氮和亚硝酸盐氮均出现了波动。通过调整曝气参数，使DO质量浓度维持在2 mg·L−1左右。相比之下，尹子华[19]采用小试MBR装置富集硝化菌，进水中含有一定浓度的有机碳源以及较短的HRT（4 h），出现出水氨氮不稳定以及亚硝酸盐氮波动等问题。DO的下降反映出该培养池内污泥对DO的需求变化，结合进出水氨氮和亚硝酸盐氮的指标分析，培养池内的DO降低反映出硝化菌在培养池内的浓度逐渐增加。
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MBR装置中硝化污泥的硝化活性如图4所示。接种后培养第20 d，硝化活性为28 mg·(L·h)−1(以NH4+计)。随着进水氨氮浓度的增加，硝化活性也逐渐增加。进入快速富集阶段后，进水氨氮浓度接近800 mg·L−1时，硝化活性显著提高到最大值，为122 mg·(L·h)−1(以NH4+计)，达到普通活性污泥的27倍，之后装置运行进入稳定阶段，硝化活性逐渐稳定在85 mg·(L·h)−1(以NH4+计)。崔灿灿[20]的中试MBR装置富集培养硝化菌的过程中采用实际细格栅水质与培养液混合为进水，硝化菌最高硝化活性达到98.41 mg·(L·h)−1(以NH4+计)左右，稳定的硝化活性在72.39 mg·(L·h)−1(以NH4+计)。尹子华[19]使用小试MBR装置富集硝化菌，采用有机碳源的高氨氮模式培养硝化菌，进水氨氮质量浓度最高达到500 mg·L−1左右，HRT为4 h，硝化活性最高为108 mg·(L·h)−1(以NH4+计)。相比之下，本研究进水氨氮质量浓度增至约800 mg·L−1，HRT相应的增加到20 h，进一步提升了水体中硝化菌的浓度，使得本研究富集的污泥的硝化活性相比于尹子华的结果提升近20%左右。这表明采用无机碳源的高氨氮培养模式，对于提升硝化菌的硝化活性具有极为重要的意义。
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高硝化活性污泥中的不同种类的硝化菌含量如图5 所示。污泥的鉴定结果表明，污泥中主要是Nitrosomonas 属的氨氧化菌（ammonia - oxidizing bacteria, AOB），鉴定出的细菌种为Nitrosomonas nitrosa、Nitrosomonas sp. LT-4和Nitrosomonas sp. ENI-11，其在Nitrosomonas属的硝化菌中的占比分别为 39.9%、31.2%和 28.9%。有研究[21]发现，AOB的主要菌属Nitrosomonas是属于r-策略细菌，具有增长迅速、生长周期长、耐变性高和竞争性强的特点。而亚硝酸盐氧化菌（nitrite - oxidizing bacteria, NOB）的主要菌属Nitrospira是属于 k-策略细菌，具有增长慢、生长周期长、耐变性低和竞争性弱的特点。此外，有研究[21]表明，Nitrosomonas有着相对较高的基质半饱和常数以及较弱的基质亲和力，同时其拥有较高的氧亲和力，因此，Nitrosomonas更容易成为富集系统内优势AOB。
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人工湿地微生物接种分为3个阶段：第1阶段为高硝化活性硝化菌和锰氧化菌共同接种阶段，模拟人工湿地启动过程中投加多种且相互存在竞争的功能菌群的情况；第2阶段为锰氧化菌强化接种阶段，模拟人工湿地功能菌接种完成后，面对外界具有竞争性的微生物冲击情况；第3阶段为稳定运行阶段。2组人工湿地从接种到运行稳定进出水氨氮浓度变化情况如图6 所示。可见，2组不同填料的人工湿地均表现出对氨氮的高效去除能力。第1阶段接种了高硝化活性硝化菌和锰氧化菌后35 d，出水平均氨氮浓度达到0.5 mg·L−1，氨氮去除率达到93.8%。在第2阶段，硝化菌停止接种，继续接种锰氧化菌，接种45 d，增大锰氧化菌与湿地内好氧菌群之间的氧气竞争，在此阶段出水氨氮出现明显提高，平均氨氮质量浓度从0.2 mg·L−1增加到最高2.5 mg·L−1。但此时氨氮去除率最低仍然在67.5%以上，在此阶段火山岩-CW具有67.5%-79.5%的氨氮去除率，矿石-CW的氨氮去除率持续降低到49.2%。火山岩-CW相比于矿石-CW在第二阶段表现出更低的出水氨氮浓度，在第2阶段末期，火山岩-CW的出水氨氮质量浓度从 2.5 mg·L−1降低到1.6 mg·L−1，而矿石-CW出水氨氮质量浓度则持续升高，最高达到了3.8 mg·L−1。进入第3阶段，硝化菌的高硝化活性影响逐渐凸显，人工湿地在10 d内明显恢复了对氨氮的去除效率。稳定阶段后出水氨氮迅速降低，出水氨氮平均去除率从68.8%增加到98%以上。邹铭等[22]在含有铁锰矿石填料的小试人工湿地中接种了二沉池污泥，HRT为1 d，对于低污染水质氨氮的去除率只有67.1%。于越等[23]在不同填料的人工湿地处理污水处理厂尾水的小试实验中，水力负荷0.4 m·d−1，采用自然接种微生物的方法，人工湿地系统在曝气的情况下氨氮的去除率最高达到80%。由此可见，相比于未接种高硝化活性硝化菌的人工湿地，接种了高硝化活性硝化菌的人工湿地能实现脱氮的快速启动，实现对氨氮的高效去除，并具有一定的抗冲击的能力。
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根据接种了高硝化活性污泥的人工湿地中上层填料的微生物测序，测序结果中硝化菌含量如图7 所示。检测出与硝化菌有关的菌属有两类，分别为与AOB有关的Nitrosomonas 属和与NOB有关的 Nitrospira菌属。这两类菌属在火山岩-CW中的占比分别为5.5%和2.5%，在矿石-CW中的占比分别为2.1%和1.4%。对比而言，NOB在人工湿地系统中的含量低于AOB，与接种的活性污泥相比，NOB在人工湿地中上层填料中的含量占比有所提升。Nitrospira作为一种常见的k-策略菌，有着较强的基质亲和力和较低的基质半饱和常数，同时有着较强的DO亲和力，因此对低浓度NO2−和DO都有着较强的适应[22]。根据人工湿地中硝化菌群的占比发现，在火山岩-CW中硝化菌群占微生物总群落的8.1%，在矿石-CW中硝化菌群占微生物总群落的3.5%。沈宝进[24]采用自然挂膜的方法为人工湿地挂膜，在不同填料的湿地中硝化菌群落丰度最高为2.1%；李超予[25]采用稀释的厌氧污泥为人工湿地挂膜，在不同功能填料的人工湿地中硝化菌群落丰度最高为2.2%。相比于沈宝进、李超予的人工湿地实验，本研究在人工湿地中接种高硝化活性污泥，湿地中的硝化菌群落丰度有明显增加，从提升硝化菌在湿地中群落丰度的途径进一步提升了人工湿地的硝化能力。
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1）本研究采用MBR装置，通过无机碳源以及逐级提高氨氮浓度实现了高活性硝化菌的快速富集。进水氨氮浓度为800 mg·L−1，HRT=20 h时，能有效去除氨氮和亚硝酸盐氮。在DO降低的限制下，最高硝化活性仍然能达到122 mg·(L·h)−1(以NH4+计)，是普通活性污泥的27倍，稳定期污泥的硝化活性能达到85 mg·(L·h)−1(以NH4+计)左右，证明无机碳源高氨氮培养模式在提高硝化菌的硝化活性方面具有重要意义。
2）对硝化污泥的菌种鉴定结果可知，在硝化污泥里，优势种群是与AOB存在关联且属于 Nitrosomonas 属的硝化细菌，其中 Nitrosomonas nitros占比 39.9%，Nitrosomonas sp. LT-4占比 31.15%，Nitrosomonas sp. ENI-11占比 28.87%。
3）在人工湿地启动阶段接种高硝化活性的硝化菌和其他具有竞争性的功能微生物，短期( 35 d)就能够实现出水氨氮质量浓度降低到0.5 mg·L−1，氨氮去除率达到93.8%，在面对不良条件冲击结束后，10 d内两组人工湿地均恢复了对氨氮的高效去除，去除效率达到98%以上。硝化菌在火山岩填料和矿石填料中的占比分别为 8.1%和3.5%，在人工湿地的启动阶段，投加具有高硝化活性的污泥，有助于提升系统内部硝化菌群落的丰度，强化系统对氨氮的去除以及整体的脱氮能力，特别是在遭遇外界冲击时，能够迅速恢复脱氮功能。
高硝化活性细菌富集及强化人工湿地脱氮
Enrichment of high activity nitrifying bacteria and its application for enhanced nitrogen removal in constructed wetlands
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摘要: 在污水处理中投加高硝化活性的污泥是脱氮工艺快速启动的重要方式之一，同时也是生物脱氮技术响应应急脱氮处理的主要手段。该研究选用膜生物反应器（MBR）作为硝化菌的富集装置，运用无机碳源与高浓度氨氮培养模式，同时对 pH、DO、温度以及水力停留时间进行合理调控，实现了硝化菌的快速富集。随后将富集得到的硝化菌投加到人工湿地中，模拟人工湿地的快速启动流程，最终实现了人工湿地的快速启动以及高效脱氮效果。结果表明，在整个硝化菌富集实验中，氨氮的去除率稳定在90%以上，并同时有效避免了亚硝酸盐氮的累积问题，实现了出水水质稳定。富集后污泥的硝化活性从最初的4.8 mg·(L·h)−1(以NH4+计)显著提高到122 mg·(L·h)−1，达到普通污泥的27倍。将富集后的高硝化活性污泥投加进中试人工湿地中，能实现人工湿地系统在35 d的快速脱氮启动，并对氨氮的去除率达到93.8%，即使长时间遭受具有竞争性外源菌的干扰，该人工湿地也只需 10 d即可恢复对氨氮的高效去除，去除率可达到 98% 以上。由此可见，投加这种高硝化活性的污泥，不但能够提升人工湿地里硝化菌群落的丰富程度，而且借助强化硝化能力，可进一步增强人工湿地的脱氮效能。Abstract: The addition of sludge with high nitrification activity in wastewater treatment is one of the important ways to quickly start nitrogen removal process, and it is also the main method for biological nitrogen removal technology to respond to emergency nitrogen removal treatment. A membrane bioreactor (MBR) was applied for the enrichment of nitrifying bacteria in this study. The nitrifying bacteria were cultivated with inorganic carbon sources and high concentration ammonia nitrogen, pH, DO, temperature and hydraulic retention time were appropriately adjusted, then the rapid enrichment of nitrifying bacteria was achieved. The enriched nitrifying bacteria were added to the artificial wetland for the simulation of its rapid start-up process, finally, the rapid start-up and highly efficient nitrogen removal were achieved for artificial wetland. This results showed that in the nitrifying bacteria enrichment experiment, the removal efficiency of ammonia nitrogen was stable at over 90% and the accumulation of nitrite nitrogen was effectively avoided, the stable effluent water quality occurred. The nitrification performance of the enriched sludge significantly increased from the initial value of 4.8 mg·(L·h)−1 (calculated as NH4+) to 122 mg·(L·h)−1 (calculated as NH4+), which is 27 times that of conventional nitrifying sludge. Adding the enriched nitrifying sludge with high activity into the pilot-scale wetland could achieve a rapid start-up of nitrogen removal by the artificial wetland system within 35 days, and ammonia nitrogen removal rate reached 93.8%. Even at the interference of long-term competitive external bacteria, the highly efficient ammonia nitrogen removal could be restored within 10 days for the artificial wetland, and the ammonia nitrogen removal rate was over 98%. Therefore, the addition of sludge with high nitrifying activity not only enhances the abundance of the nitrifying community in artificial wetland, but also further improves the nitrogen removal capability of artificial wetland by means of the strengthened nitrification capacity.
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图 5 不同种类硝化菌在硝化菌中的占比
Figure 5. Proportion of different types of nitrifying bacteria in the nitrifying bacterial community
图 6 人工湿地进出水氨氮浓度变化图
Figure 6. Changes in ammonia nitrogen concentration of influent and effluent of the constructed wetland
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