本研究采用的AX-MBR装置如图1所示。整个反应器以有机玻璃为主，分为缺氧反应器、好氧反应器、膜组件3个部分。其中，膜组件放置于好氧反应器中。缺氧反应器的有效容积为4 L，长、宽、高为9 cm×9 cm×74 cm；好氧反应器有效容积为6 L，长、宽、高为18 cm×10 cm×50 cm。生活污水先在缺氧反应器中经过微生物处理，再经过好氧反应器中的微生物处理和膜组件过滤。缺氧反应器进水口设置有液位控制器并连接进水泵，用于控制进水。挂膜有AnAOB的聚氨酯填料放置于缺氧反应器，投加量为2 L。2个反应器间设有1台回流泵，膜组件出水通过时间控制器控制。其中，2^#和4^#为出水调节阀，1^#和3^#为反冲洗调节阀，用来调节出水和反冲洗时间，二者时间比为9:1。反应器采用黑布遮盖，避免光线对细菌的影响^[12]。

本研究接种污泥主要来自桂林市雁山污水处理厂，并配以课题组自行培养且具有较好活性的AnAOB，通过方形的聚氨酯填料进行固着^[13-14]。实验用水为桂林理工大学的校园生活污水^[3]。此外，进水先经过制氮机吹脱降低污水中的溶解氧 (DO) ，以便后续调节、控制反应系统中的DO指标。实验分成3个阶段 (共248 d) 。在I阶段取适量污水厂好氧池内污泥投加入反应器，校园生活污水作为进水，进水TN为70.16~123.25 mg·L⁻¹ ，NH₄⁺-N为42.5~85.6 mg·L⁻¹，COD为110.88~174.72 mg·L⁻¹。在系统启动并稳定运行后，降低好氧反应器DO至0.5 mg·L⁻¹，共运行14 d。在II阶段投加600 mL厌氧氨氧化污泥，并继续保持DO低于0.5 mg·L⁻¹，其余运行条件不变，共计130 d。在III阶段，从第146天开始共运行102 d，主要考察温度对AX-MBR工艺的影响。3个阶段均未对反应器进行温度控制，实验期间的水温为5~35 ℃。水力停留时间 (HRT) 控制在4 h，回流比为1:2，DO小于0.5 mg·L⁻¹，pH为7.45~7.55。

NH₄⁺-N：纳氏试剂分光光度法；NO₂⁻-N：N-(1-奈基)-乙二胺光度分光光度法；TN：碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法；COD：重铬酸钾微波快速密闭消解法；pH/温度：北京天健在线监测DEC数字化pH计DPH10AC；DO：美国哈希便携式溶解氧仪^{[5, 15]}。

取AX-MBR系统稳定运行后的污泥并进行预培养以消耗样本中残留的O₂和NO_x⁻。样品分为3个组，分别为E-0、E-A和E-D。E-0加¹⁵NH₄⁺检验预培养过程是否耗尽O₂和NO_x⁻，并排除由纯化学反应生成N₂的可能性；E-A组添加¹⁴NO₃⁻和¹⁵NH₄⁺检测污泥中anammox反应；E-D组添加¹⁵NO₃⁻与样品本底的¹⁴NH₄⁺发生anammox和反硝化反应，用于定量分析anammox的反应速率和脱氮贡献率。同位素示踪法具体步骤和计算方法参考文献[16]。

对实验不同阶段的污泥进行取样，委托生工生物工程 (上海) 有限公司进行高通量测序分析，以探究微生物多样性和优势菌种的变化，具体测序步骤参考文献[5]。进行3次采样共6个样品，分别取缺氧反应器和好氧反应器的污泥。第一次取样为AX-MBR工艺成功启动并稳定运行 (50 d)，分别为Y1、H1；第二次取自III阶段(230 d)，主要研究低温环境下群落结构的变化，记为Y2、H2；最后一次取样则是所有实验结束后(248 d)，分别是H3、Y3。

在AX-MBR工艺运行过程中各氮素质量浓度变化如图2所示。在I阶段通过减少曝气量控制反应器的DO，从0.89 mg·L⁻¹逐渐降至0.5 mg·L⁻¹以下。该阶段出水NH₄⁺-N质量浓度增加，最高为34 mg·L⁻¹，出水NO₂⁻-N质量浓度并随之增加。该阶段的AOB对氧的半饱和系数大于NOB，NOB在低DO下竞争氧能力较弱，系统可能由短程硝化的原因产生NO₂⁻-N的积累。第II阶段投加了AnAOB污泥后，NH₄⁺-N去除率迅速增加，最后去除率稳定为约89%。这说明anammox作用具有高效脱氮的能力。第III阶段结果表明，随着运行天数的增加，温度降低会导致微生物活性降低，NH₄⁺-N和TN去除率逐渐降低，NH₄⁺-N去除率从最开始的84%将至58%，TN去除率也从67%将至47.28%。这说明温度对AX-MBR的脱氮效率具有较大影响。

在AX-MBR运行过程中，进水COD约为111~171.36 mg·L⁻¹，出水COD约为21.77~50.4 mg·L⁻¹，降低了58%~80%，可达到城镇污水处理厂污染物排放标准 (GB18918-2002) 的一级标准。从I阶段到III阶段，出水COD没有明显变化，在整个运行过程中保持稳定的处理效果。一方面，反应系统的微生物中存在着消耗有机物质的异养菌；另一方面，膜组件的有效过滤阻断作用也可保证出水COD的稳定性。

为考察温度变化对AX-MBR工艺脱氮性能的影响，将III阶段温度从低到高排列，以间隔5 ℃为一组，探究温度在5~35 ℃时的脱氮情况及厌氧氨氧化和反硝化的脱氮贡献量，结果如图3所示。NH₄⁺-N的平均去除率随温度的增加逐渐由59%增至87%，TN去除率也从49%升至73%。当温度大于20 ℃时，NH₄⁺-N去除率维持在较高水平，平均去除率达85%以上；当温度小于20 ℃时， NH₄⁺-N和TN去除率都有所下降，此时温度降低开始影响微生物基础代谢的能力。这说明反硝化和厌氧氨氧化等脱氮反应速率受温度影响而降低。由于外回流会促进NH₄⁺-N硝化产物NO_x⁻-N在缺氧阶段被去除，而且反应器硝化液回流比为1∶2，理论上反硝化的最大脱氮贡献率为33.3%，因此可根据最大的反硝化脱氮贡献率和已知的总脱氮量推导出anammox的脱氮贡献量。当温度为25~30 ℃时，工艺总脱氮量为76.74 mg·L⁻¹，anammox和反硝化作用的脱氮贡献量为51.42 mg·L⁻¹ 和25.32 mg·L⁻¹。当温度为20~25 ℃时，工艺总脱氮量下降了17.12 mg·L⁻¹，anammox和反硝化的脱氮量为39.95 mg·L⁻¹和19.67 mg·L⁻¹，当温度为15~20 ℃时，工艺总脱氮量再次降低3.14 mg·L⁻¹。因此，随着温度的降低，微生物活性下降，脱氮量也逐渐降低，但整体上anammox的脱氮贡献率大于反硝化贡献率，anammox和反硝化作用二者同时保证AX-MBR工艺的高效脱氮性能。当温度在20~30 ℃范围内时，温度每下降1 ℃，anammox活性会降低约2.23%，而温度在15~20 ℃时每降低1 ℃，anammox活性下降1.05%。由于AnAOB和反硝化细菌的生存温度范围较广，但细菌的活性受温度影响较大，低温时活性降低，AnAOB和反硝化效率降低。AX-MBR工艺在低温环境运作时，可采用降低进水氮负荷的方法来保证处理效果，其他相关研究也表明可采用提高生物量和降低氮负荷等方式降低低温对AnAOB或其他菌活性的抑制作用^[17-18]。

本研究通过¹⁵N同位素示踪法探究anammox和反硝化脱氮贡献率，验证上述AX-MBR稳定运行过程中各反应的脱氮贡献率。污泥取自稳定运行阶段的缺氧反应器。将污泥先进行离心，超纯水也经氦气吹脱20 min至厌氧状态，最后以1:5的泥水比例混匀，并分为E-0、E-A和E-D 3组。E-0组无²⁹N₂、³⁰N₂生成，这表明样品经预处理后NO_x⁻消耗殆尽，E-A组²⁹N₂产量随时间变化明显积累且³⁰N₂无积累，因此该组只存在anammox反应。E-D组均有²⁹N₂和³⁰N₂积累，这说明该组同时发生anammox和反硝化反应。由于¹⁴NO₃⁻的存在使得E-D组的反硝化反应产物包含有²⁸N₂、²⁹N₂和³⁰N₂，而anammox的产物只有²⁸N₂和²⁹N₂，进而通过³⁰N₂的量可以反推出反硝化所产生的N₂总量，最后得出anammox的脱氮贡献率和潜在速率。由图4可知，AX-MBR工艺的anammox潜在速率为0.04~0.29 µmol·(L·h)⁻¹，反硝化速率为0.02~0.17 µmol·(L·h)⁻¹，厌氧氨氧化潜在速率较反硝化的速率高。不同反应时间可对应系统的HRT，当反应时间为2 h时，anammox脱氮贡献率为69.83%，并且为最大脱氮贡献率，但微生物反应不充分出水氮素质量浓度较高，不予采用。当反应4 h时，与实际运行HRT一致，此时anammox脱氮贡献率为60.11%。由于微生物作用的系统脱氮贡献率受HRT的影响，故反应进行6 h时的anammox脱氮贡献率增加为64.93%。较长的HRT会导致微生物颗粒污泥发生裂解，故当HRT大于6 h之后，会出现anammox脱氮贡献率下降的趋势。本研究为实验室规模小型反应器，其微生物组成与丰度受人为控制，anammox的脱氮贡献率始终大于反硝化反应，但这也进一步说明AX-MBR工艺中以anammox脱氮为主。

本研究采用16S rDNA高通量测序分析AX-MBR工艺中微生物群落结构及多样性的变化，从微生物的角度阐释其脱氮的机理。表1 通过不同多样性指数来评估微生物多样性特征，耦合系统中各样品的OUT数目变化情况见图5。结合图5和表1可知，系统的微生物为适应环境在不断的变化，群落多样性和丰度都在变化，但整体上工艺脱氮效果稳定，具有一定的耐冲击负荷的能力。其中，Y2、H2的特异OTU数目较Y1、H1有变化，主要因为低温环境中微生物优胜劣汰，但也唤醒了反应器内更多的低温菌。从3次样品的多样性指数来看，样品群落结构复杂、物种数目多、丰度较高。从Shannon指数、ACE指数和Chao1指数分析发现Y2、H2的指数值较Y1、H1高。这说明温度变化可能唤醒了工艺中的低温菌，原有优势菌种对温度耐受能力强，故群落多样性和丰度增加。综上所述，系统的微生物为适应环境在不断的变化，群落多样性和丰度都在变化，但整体上污水脱氮处理效果稳定，具有一定的耐冲击负荷的能力。

实时监测数据显示缺氧和好氧反应器的DO较低。因此，硝化作用及部分硝化驱动的anammox过程造成的氨氮损失是有限的。因此，短程反硝化可能是与anammox结合的主要途径，且导致缺氧和好氧反应器的氨氮损失可能是反硝化和anammox作用。AX-MBR中各样品的分类和系统发育信息可视化、门水平的物种丰度堆叠条形图、属水平的物种丰度柱状图见图6。Proteobacteria、Patescibacteria和Bacteroidetes门是絮状污泥中含量最多的3个门。这些门已被报道为负责氮和碳循环的典型门，并且已在以前的 PD/A 系统中广泛检测到^[19]。在缺氧和好氧反应器污泥样品中，观察到Proteobacteria和Bacteroidetes、Acidobacteria为优势属。Bacteroidetes占比约40%，但 H3、Y3中Bacteroidetes有所下降。

图6 (c) 中AnAOB主要为Candidatus Kuenenia，相对丰度为1.7%。Armatimonadetes-gp5属于装甲菌门，与AnAOB菌属存在关联性^[20]。由于AnAOB具有生长速率缓慢、低温抑制菌活性等原因，具有anammox的Candidatus Kuenenia菌属对环境温度敏感，其H1、Y1中Candidatus Kuenenia相对丰度较H1、Y1和H3、Y3样品相比最低，说明低温可能会促进NO₂⁻-N积累，这与GAO等^[21]的研究一致，即PD/A工艺在低温条件下能实现较好的脱氮效果。在属水平中，厌氧和缺氧反应器的反硝化细菌 (Aridibacter 、Pseudomonas、Paracoccus, Planctomicrobium、Bacillus和Thauera) 丰度远大于AOB丰度，其中AOB (Nitrosomonas) 丰度均小于NOB (Nitrospira) 丰度，故污水中亚硝酸盐主要来源于部分反硝化，这在群落水平上证明了PD/A的存在。

1) AX-MBR工艺可成功实现anammox工艺应用于处理低氨氮生活污水，工艺运行稳定，NH₄⁺-N去除率可稳定在89%左右，COD去除率稳定在75%左右，出水可达到城镇污水处理厂污染物排放标准 (GB18918-2002) 的一级标准。

2) 随着季节温度变化，微生物活性下降导致氮元素去除效率逐渐降低，但anammox的脱氮贡献率始终大于反硝化贡献率，这说明anammox脱氮占据主体地位。AX-MBR工艺中anammox和反硝化作用二者同时保证了工艺的高效脱氮性能，这表明AX-MBR工艺可为anammox工艺的工程应用提供参考。

3) 反应器中微生物群落结构复杂，反硝化细菌丰度大于AOB丰度，且好氧反应器回流至缺氧反应器时给反硝化菌提供NO₃⁻，故污水中NO₂⁻主要来源于部分反硝化。这在群落水平上证明了PD/A的存在。