在北京某退役焦化厂厂房附近选取有代表性的、多年未经扰动地段的土壤样地(N 39°51′0.42″，E 116°31′38.83″)进行采样。供试土壤采自该样地0~20 cm的表层土，其pH为8.64，总碳含量为16.60%，总氮含量为0.24%，总硫含量为0.56%，有机质含量为8.20%。供试土壤中PAHs含量如表1所示。

本研究所使用的主要药品：芘、菲、苯并[b]荧蒽等多环芳烃(纯度大于97%，美国AccuStandard公司)；正己烷、甲醇、丙酮等有机试剂(色谱纯，美国Tedia公司)；琼脂粉等非有机试剂(分析纯，国药集团化学试剂)。

LB培养基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，加蒸馏水定容至1 000 mL。固体培养基则再加入2%琼脂粉。无机盐培养基：KH₂PO₄ 5.5 g、K₂HPO₄ 6.0 g、KCl 2.0 g、MgSO₄·7H₂O 0.2 g、Na₂SO₄ 2.0 g、微量金属盐1.0 mL (MnSO₄ 39.9 mg，ZnSO₄·H₂O 42.8 mg，(NH₄)MoO₂·4H₂O 34.7 mg，蒸馏水1 000 mL)、蒸馏水1 000 mL、pH 7.0。固体培养基则再加入2%琼脂粉。选择性无机盐液体培养基：在已灭菌的无机盐培养基中加入一定量PAHs的丙酮溶液，则可得到含PAHs的无机盐液体培养基。PAHs溶液及无机盐液体培养基加入量根据所需PAHs浓度添加。含芘的无机盐固体培养基：采用平板升华法^[11]，在无机盐固体培养基上镀一层芘膜。

1) PAHs降解菌的富集分离与筛选。采用富集培养法从污染土壤中将PAHs降解菌富集，然后用含芘的选择性培养基和平板划线的方法将降解菌分离^[12]，最后用含苯并[a]芘(50 mg·L⁻¹)的选择性培养基对降解菌进行进一步的筛选。将各菌株对数期(OD₆₀₀为0.8)菌悬液按10%的体积比(5 mL)，接种于含50 mg·L⁻¹苯并[a]芘的选择性无机盐液体培养基(45 mL)中，使液体培养体系为50 mL，同时设置无菌对照组，每组实验均设置5个重复处理。然后置于180 r·min⁻¹，37 ℃摇床中避光振荡，培养8 d后，测定各菌株对苯并[a]芘的降解率，根据降解率对菌株进行二次筛选。

2) PAHs降解菌的鉴定。在进行分子生物学鉴定时，提取菌株Q3的DNA，用16S rDNA通用引物PCR扩增其16S rDNA基因序列。其中16S rDNA通用引物为厦门博瑞生物技术有限公司合成的引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT。扩增体系为25 μL Premix Ex Taq 酶(2×)、2 μL DNA(DNA浓度约10 μmol·L⁻¹)、上游引物和下游引物各1 μL(引物初始浓度10 μmol·L⁻¹)、灭菌水补足50 μL。扩增条件为94 ℃ 15 s、58 ℃ 35 s、72 ℃ 35 s、40个循环。将扩增产物送去厦门博瑞生物技术有限公司测序，测序结果在Ezbiocloud网站进行相似性比对，用MEGA 6.0进行序列相似性分析，构建系统发育树。表型特征鉴定与保藏工作委托中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)完成，保藏编号为CGMCC No.16446。

3) PAHs降解菌生长特性分析。将Q3菌液分装后，于3 500 r·min⁻¹下离心10 min，弃上清液后，加入等量已灭菌的无机盐液体培养基，即制得Q3菌悬液。本研究以菌液在OD₆₀₀处的吸光度为考察指标，考察了Q3最适生长温度、pH及盐度。将对数期(OD₆₀₀为0.8)菌悬液按10%的体积比(5 mL)接种于含有1% NaCl的LB培养基(45 mL)中，使液体培养体系为50 mL，同时设置无菌对照组，每组实验均设置5个重复处理。设置LB培养基初始pH分别为5、6、7、8、9，于180 r·min⁻¹37 ℃摇床中避光振荡培养，再连续取样测定菌液OD₆₀₀变化，以探究菌株Q3最适生长pH。按照上述步骤，将对数期菌液按10%的比例接种于pH为7的LB培养基中，将LB培养基中的NaCl含量分别设置为0.1%、0.5%、1%、2%、3%、5%，以探究Q3最适生长盐度。将对数期菌液按10%的比例接种于pH为7、NaCl含量为1%的LB培养基中，分别设置摇床温度为25、30、37、40 ℃，以探究Q3最适生长温度。

4) PAHs降解菌降解性能分析。按照上述方法，制备芘(50 mg·L⁻¹)选择性无机盐液体培养基(45 mL)，并接种10% OD₆₀₀=0.8的Q3菌悬液(5 mL)，使液体培养体系为50 mL，同时设置无菌对照组，每组实验设置5个重复处理。然后置于37 ℃ 180 r·min⁻¹摇床中避光振荡培养，分别于第2、4、8、12、16天破坏性取样测定锥形瓶中芘残余量。

在考察不同初始浓度对芘降解的影响时，按照上述步骤，培养8 d后，测定该菌株对初始含量分别为25、50、100、200 mg·L⁻¹芘的降解率。

在对菌株Q3降解广谱性进行研究时，按照上述步骤，分别测定该菌株对菲(50 mg·L⁻¹)、芘(50 mg·L⁻¹)、苯并蒽(50 mg·L⁻¹)、䓛(50 mg·L⁻¹)、苯并[a]芘(50 mg·L⁻¹)、苯并[b]荧蒽(10 mg·L⁻¹)、苯并[k]荧蒽(10 mg·L⁻¹)、二苯并[a,h]蒽(10 mg·L⁻¹)、苯并[g,h,i]苝(10 mg·L⁻¹)培养8 d或16 d后的降解率。

在考察菌株Q3对混合PAHs模拟液的降解效果时，按照上述步骤，测定该菌株对包含菲(50 mg·L⁻¹)、芘(50 mg·L⁻¹)、苯并[b]荧蒽(10 mg·L⁻¹)和苯并[a]芘(50 mg·L⁻¹)的混合PAHs培养8 d后的降解率。

在考察菌株Q3对土壤PAHs的去除效果时，称取10 g供试土壤置于250 mL锥形瓶中，加入90 mL无机盐液体培养基，用灭菌锅灭菌30 min后备用。将Q3菌悬液按照与土壤体系重量比为10%的比例(10 mL)，分别接种于灭菌/未灭菌土壤培养体系(10 g供试土壤，90 mL无机盐液体培养基)中，同时设置对照组，每组实验设置5个重复处理，所有处理均置于37 ℃ 180 r·min⁻¹摇床中，避光振荡培养24 d后，测定土壤中PAHs去除率。

5) PAHs含量测定。液相PAHs含量的测定参照国标HJ 478-2009^[13]。以萃取剂样品比为3∶10的比例向样品溶液中加入正己烷，于摇床中振荡提取30 min，静置后分离收集有机相。上述萃取步骤重复3次，收集合并所有萃取液旋蒸至2 mL左右，并用甲醇定容至10 mL，取1 mL过0.45 μm有机滤膜后，置于棕色色谱瓶中待HPLC分析。分析仪器为日立L-2000液相色谱仪，采用C18反向色谱分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇/水(体积比9∶1)，流速为1 mL·min⁻¹，检测波长为254 nm，柱温为35 ℃，进样体积为10 μL。

土壤PAHs含量检测步骤如下：将土样置于ASE350中萃取，萃取溶剂采用二氯甲烷∶丙酮=1∶1的混合溶剂。萃取条件：湿度为100 ℃，时间为5 min；大气压为10 342.5 kPa；静态提取5 min，循环3次，氮气吹扫100 s。萃取液在39 ℃水浴锅中完成浓缩与溶剂替换，溶剂替换为正己烷，过硅胶-氧化铝净化柱净化后，氮吹至1 mL，装入色谱瓶，用GC-MS测定。本研究中全部样品替代物的回收率为42%~120%。

以空白对照处理组PAHs含量为基础，菌株对液相PAHs的降解率(D_a)、对土壤PAHs的去除率(D_s)分别按照式(1)和式(2)进行计算。

式中：R_c为对照组液相PAHs残余量，mg·L⁻¹；R_s为实验组液相PAHs残余量，mg·L⁻¹；R_m为供试土壤PAHs初始含量，mg·kg⁻¹；R_s1为实验组土壤PAHs残余量，mg·kg⁻¹。

本研究以芘为底物进行PAHs降解菌的初筛，以含苯并[a]芘的选择性培养基进行复筛，最终得到一株PAHs的高效降解菌Q3。该菌株在LB固体培养基上菌落形态如图1所示。

菌株Q3经16S rDNA测序和Ezbiocloud比对结果表明，Q3与玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)相似性为99.79%，其系统发育树如图2所示。结合该菌株生理生化特征(表2)，初步鉴定菌株Q3为玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)。

通过测定不同pH、温度及盐度培养条件下菌液OD₆₀₀的吸光度变化，绘制了不同条件下菌株的生长曲线(图3)。实验结果表明，Q3最适生长的pH为7，温度为30~37 ℃，盐度为1%。盐度和pH是影响PAHs降解菌生长代谢的重要因素^[14-15]。高盐度可能会引起微生物体内蛋白质等大分子物质变形，破坏微生物细胞结构或抑制一些重要的生物反应；高盐度也可能使环境中氧浓度减少，从而降低微生物代谢活性^[14]。环境pH会影响微生物细胞膜所带的电荷，改变某些化合物分子进入细胞的状态，从而促进或抑制微生物的生长；强碱环境可能会破坏细胞质膜、抑制酶活性并影响膜运输蛋白的功能，从而抑制微生物生长^[15]。赵百锁等^[16]的研究表明，当盐浓度高于3%、pH大于9时，微生物的代谢活性显著受到抑制。顾平等^[17]的研究也发现，强酸、强碱条件对PAHs降解菌株BB-1的生长具有抑制作用。而本研究中菌株Q3在pH为9，盐度为5%时均可正常生长，这表明该菌株具有一定的耐盐性和耐碱性。

1)菌株Q3对单一芘的降解效率。在实验过程中，在无菌处理的对照组中，各采样时间点对应的芘浓度没有发生显著变化。菌株Q3对典型PAHs芘的降解率见图4。结果表明，菌株Q3能够降解体系中的芘，在以50 mg·L⁻¹芘为唯一碳源的无机盐培养基中，菌株Q3第4天对芘的降解率为33%，第8天可达47%。在8~16 d内，Q3对芘的降解率没有显著变化，这可能是由于菌株Q3对芘的代谢中间产物具有生物毒性，从而抑制了该菌株的生长代谢，进而导致芘去除率相对稳定^[18]。RAVELET等^[19]的研究也表明，芘的代谢产物醌毒性比芘更大，对微生物生长具有显著抑制作用。菌株生长处于稳定期或衰亡期，代谢过程无增加也可能是芘去除率几乎无变化的原因之一^[20]。王春明等^[21]的研究也发现了类似的现象，微杆菌培养到第6天时，即在对数期时，培养液中蒽浓度开始明显下降；培养到第16天时，菌体处于稳定期，在第16~22天蒽几乎不被降解。

2)不同初始浓度对芘降解的影响。为探究Q3对PAHs的耐受能力，本研究测定了不同芘初始浓度下Q3芘降解量及其芘降解效率(图5)。在实验处理过程中，在各无菌对照处理中芘的浓度未出现显著变化。分析结果表明，菌株Q3能够降解体系中高浓度(200 mg·L⁻¹)芘，且对芘具有耐受性，随着初始芘浓度的增加，体系中芘的降解量也随之增加。

3)菌株Q3降解广谱性。在实验过程中，各无菌对照处理中PAHs单体的浓度均没有显著变化。菌株Q3降解广谱性如表3所示。菌株Q3培养8 d后，对初始浓度为50 mg·L⁻¹的菲、芘、苯并蒽、䓛和苯并[a]芘均有显著的降解效果，但对苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、二苯并[a,h]蒽和苯并[g,h,i]苝无降解作用。将上述菌株Q3对其无降解效果的苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、二苯并[a,h]蒽和苯并[g,h,i]苝的初始浓度由50 mg·L⁻¹降低至10 mg·L⁻¹，并延长培养时间至16 d后，菌株Q3对苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、二苯并[a,h]蒽和苯并[g,h,i]苝产生了显著的降解效果。综上所述，菌株Q3对菲、芘、苯并蒽、䓛、苯并[a]芘、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]苝等9种PAHs均具有一定的降解效果，对PAHs的具有降解广谱性。Q3对各类环境标准中的指示污染物—苯并[a]芘既具有较好的耐受能力，可降解初始浓度为50 mg·L⁻¹的苯并[a]芘，也具有较高的降解能力，培养8 d后，对其降解率可达65%。

近年来，已有的大量研究从不同环境中筛选分离得到200余种不同类别的PAHs降解菌，但筛选出的菌株普遍降解底物范围较窄^[22]。有研究表明，玫瑰色红球菌具有较好的有机污染物降解能力，如石油烃^[23]、二苯并噻吩^[24]、卤代烷烃^[25]等，而利用其降解PAHs的研究较少。关于其他种类可降解PAHs的红球菌虽已有所报道，但是其降解率相对较小，且可降解的底物范围较窄。SONG等^[26]从石油污染的沉积物中筛选分离出一株红球菌Rhodococcus sp. P14，其只对菲、芘、苯并[a]芘3种PAHs具有降解效果，且培养30 d后，其对50 mg·L⁻¹菲、芘和苯并[a]芘的降解率分别为43%、34%和30%，低于本研究中Q3对菲、芘和苯并[a]芘的降解率。刁硕等^[27]筛选分离的红球菌DYC-1对苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽无显著代谢作用，只可降解菲、芴、荧蒽。WALTER等^[28]报道的赤红球菌可代谢芘，但要在以芘为基质的情况下才可共代谢苯并[a]芘。而本研究从PAHs污染土壤中分离出的降解菌Rhodococcus rhodochrous Q3，对苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘等9种PAHs均具有显著的降解能力，较多数已报道菌株具有更广泛的可降解底物范围。

4)菌株Q3对混合PAHs的降解。环境介质中的PAHs多以混合物形式存在，考察菌株对混合PAHs中高低环PAHs的降解效果具有重要的现实意义。在实验过程中，无菌对照处理中PAHs的浓度没有显著变化。菌株Q3对混合PAHs的降解效果如图6所示。菌株Q3培养8 d后，对4种PAHs(菲、芘、苯并[a]芘、苯并[b]荧蒽)的降解率比对照组提高了27%，对单一底物菲、芘和苯并[a]芘降解率可达到98%、47%和65%；而对混合PAHs中的菲、芘和苯并[a]芘降解率降低至57%、29%和33%。

本研究中菌株Q3可以有效地降解混合PAHs，但菌株Q3对混合PAHs中菲、芘、苯并[a]芘的降解效果显著低于其对单一菲、芘、苯并[a]芘的降解，表明混合PAHs的降解难度远大于PAHs单体。这可能是因为PAHs种类和浓度的增加显著抑制了降解菌的活性^[29]。卢晓霞等^[30]的研究发现了类似的结果，当液体培养基中16种PAHs总浓度为17 μg·mL⁻¹时，降解菌即可生长良好，且具有降解活性；但当16种PAHs总浓度为166 μg·mL⁻¹时，降解菌的生长及其活性均受到抑制。ANNE等^[31]的研究也表明，污染物浓度过高或其他毒性物质的存在显著抑制了降解菌生长。另一方面，PAHs代谢中间产物也可能会转化成有毒物质，进而抑制降解菌的活性，如芘的中间代谢产物—二氢二醇芘会转化成一种有毒中间体二醇芘^[32]。水杨酸、邻苯二酚等无毒性的代谢中间产物也可能因与PAHs共用同1个降解酶系，而对PAHs降解产生竞争性抑制作用^[33]。

菌株Q3培养8 d后，对单一底物苯并[b]荧蒽不具有显著降解作用，而对混合PAHs中的苯并[b]荧蒽降解率显著提高至24%。这可能是因为微生物利用不同碳源作为生长基质时，会诱导出不同的降解酶系，多种降解底物即碳源的存在可增加混合体系中的降解酶系，从而使苯并[b]荧蒽的降解显著提高^[34-35]。JAMES等^[36]的研究表明，对多环芳烃降解能力有限的加氧酶，能被某些多环芳烃诱导，从而提高活性增强降解作用。巩宗强等^[37]也报道了类似研究结果，芘和低分子质量多环芳烃菲存在共代谢关系，即对芘具有潜在降解性能的酶因为菲的氧化降解而增强了活性，从而促进了芘的降解。另外，低环PAHs作为碳源和能源能支持降解菌的快速生长繁殖，从而分泌更多的降解酶来促进高环PAHs和其代谢产物的降解，通过增大生物量来促进难降解物的转化^[38]。本研究中菲、芘较苯并[b]荧蒽更容易被降解，菲、芘的存在可能进一步促进了降解菌的生长繁殖，从而促进了其对苯并[b]荧蒽的降解。FENG等^[39]的研究显示，毕赤酵母(Pichia anomala)在萘存在下通过共代谢作用可增加体系中微生物数量，进而促进降解了较难降解的丁烯。李政等^[40]的研究也表明，芴和菲的存在不仅促进了降解菌的生长繁殖，而且能够促进芘的完全快速降解和芘代谢产物的降解。由此可见：混合体系中存在的多种PAHs可能诱导多种降解酶系，从而使难降解的PAHs发生变化；也可能增大微生物对碳源和能源的选择范围，促进降解菌的生长繁殖和代谢活动。

5)菌株Q3对土壤PAHs的强化修复潜力分析。为了考察菌株Q3对污染土壤中PAHs的强化修复潜力，本研究采集了野外PAHs长期污染土壤用于模拟实验。实验土壤中高环PAHs含量显著高于低环，通常这类土壤PAHs去除难度较大。菌株Q3投加后污染土壤中PAHs的去除效果如图7所示。菌株Q3培养24 d后，对灭菌和未灭菌土样中的PAHs均具有显著的强化去除效果，对灭菌土壤中16种EPA优控总PAHs(255.47 mg·kg⁻¹)去除率比对照组提高了24%，且该菌株投加后，灭菌土壤中各环PAHs的去除率均在38%以上。

菌株Q3投加处理对灭菌土壤中四环及以下PAHs的强化去除显著高于未灭菌土壤。这可能是由于未灭菌土壤培养前期菌株Q3正处于适应环境的阶段，与土壤中某些土著菌存在生长竞争，而在微生物降解研究中，低环PAHs更容易在培养前期被降解菌优先利用^[41]。因此，与土著菌的生长竞争影响了Q3对四环及以下PAHs的代谢降解。陈瑞蕊等^[42]报道了类似的研究结果，将菌根真菌应用到土壤中时，土著菌群的竞争会影响菌根真菌发挥降解作用。王聪颖等^[43]的研究也表明，土著微生物和接种的微生物会在一定程度上发生竞争作用，影响总微生物活性，进而影响微生物对PAHs的修复效果。随时间的延长，菌株Q3逐渐适应土壤环境后，代谢能力会趋于稳定，因此，灭菌与未灭菌土壤中五环及以上和总PAHs的去除率没有显著差异。王菲等^[44]也报道了类似的研究结果，外接降解菌荧光假单胞菌(Psedomonas fluorescens)和分枝杆菌(Mycobacterium sp.)逐渐适应新环境后，会由刚接入土壤时的弱势种群逐渐变强，进而发挥了显著的去除作用。由此可见，本研究中菌株Q3的适应性较强，对环境中被PAHs污染的土壤有较好的强化修复应用潜力。

1)红球菌Q3最适生长pH为7，温度为30~37 ℃，盐度为1%；同时，其具有较好的耐盐和耐碱能力。

2)红球菌Q3的性能表征结果表明，该菌株芘耐受能力强，可降解初始浓度为200 mg·L⁻¹的芘；降解广谱性高，可利用菲、芘、苯并蒽、䓛、苯并[a]芘、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]苝等9种PAHs为底物进行代谢，特别是对苯并[a]芘等高环PAHs具有较好的降解效果。

3)红球菌Q3对环境中复合PAHs污染具有一定的强化修复效果，可有效降解模拟液中的混合PAHs(菲、芘、苯并[a]芘、苯并[b]荧蒽)；菌株Q3的投加对野外PAHs长期污染土壤中16种PAHs具有较好的强化去除效果，与对照组相比，16种PAHs总去除率提高了24%。