贵州西部地区是我国燃煤污染型地方性氟中毒的重灾区[1-2]。为防止食物长期储存发生霉变,居民常使用烘干效果理想且价格相对较低的蜂窝煤进行烘干[3]。人们以堆煤或敞灶方式燃烧高氟煤取暖、做饭或烘烤食物,导致室内的空气和粮食会被氟污染[4]。摄入过量氟不仅对骨骼造成损害,还会破坏染色体DNA结构,损伤内分泌、生殖、神经等系统造成人体多方面损害[5-7]。2016年,黄开莲等[8]报道云南省富源县改炉改灶率为95%,儿童氟斑牙检出率(41.55%)相较1984—1992年(85.8%)有降低。然而,喻艳琴等[9]于2019年调查贵州省六枝特区梭戛乡8～12岁儿童氟中毒情况,发现氟斑牙患病检出率为45.26%,原因是当地部分居民仍在室内敞灶燃煤烘干食物。偏远贫困地区仍有燃煤烘烤食物的情况,燃煤烘烤粮食的污染途径和来源仍然存在[10-11],其中辣椒是燃煤型氟病区氟源之一[12]。既往研究燃煤烘烤辣椒导致氟化物富集最高可达100倍[13],但人们尚不清楚燃煤烘烤时长与辣椒氟化物富集的剂量关系。
通常人们以食物中氟化物总量评估其对靶器官产生毒性效应[14],但胃肠道的消化吸收量与食物中总量并不相同[15]。用食物中氟化物总量评估毒性危害,往往会高估其健康风险。所以了解食物中氟化物可吸收总浓度非常重要,即生物可给性(bioaccessibility, BA)[16-17]。生物可给性是指污染物在胃肠消化过程中消化吸收量与食物基质污染物总量的比值[18]。随着研究的不断深入和改进,体外实验法(in vitro)得到了较好的发展和应用,其也成为生物可给性常用的研究方法[19]。体外实验方法有很多,其中Ruby等[20]较早提出的生理原理提取法(Physiologically Based Extraction Test, PBET)成功模拟人体胃和小肠阶段的消化吸收过程,现已运用到许多研究中。人们通过体外实验模型获得有害物质被机体可利用的最高浓度水平,有助于提高风险评估的精确度[21]。
目前,越来越多学者开始引入生物可给性评价食物中有害元素的健康风险。通过美国环境保护局(United States Environmental Protection Agency, US EPA)健康风险模型[22-23]能得到某浓度有害元素是否能引起致癌风险或非致癌风险,事实上有害物质经口实际摄入量才是导致是否存在健康风险的关键因素。由于各地区经济水平、饮食习惯及地域差异,导致人们对食物偏好不同[24],因此,根据某种有害物质浓度推导人们最大日摄入量(健康风险阈值),了解每天食用含有害元素食物多少剂量会产生健康风险,对人们的生活更具有指导意义。
基于此,本文以辣椒为研究对象,探究燃煤烘烤时长与辣椒氟含量富集剂量关系及对辣椒氟生物可给性的影响,并结合生物可给性推导人群食用燃煤烘烤辣椒最大日摄入量,用于指导还可能燃煤烘烤辣椒的人群。此外,本研究为食物对氟化物富集能力及氟化物生物可给性相关研究提供参考价值,还可为饮水型氟病区地区居民每日饮水量限值推导提供理论参考依据。
1 材料与方法(Materials and methods)
1.1 辣椒样品
新鲜辣椒样品于2022年6月在贵州省六盘水市盘县某菜市场随机购买,共42份。蜂窝煤也于该地区购买。辣椒采用开放式烘烤,烘烤温度30～40 ℃,每天烘6 h,分别在烘烤0 d(对照组)、5、10、15、20、25、30 d收集样品。收样后,去除不可食用部分,用超纯水洗净,烘干,磨碎后过100目筛备用,每个样品分为3份,做3个平行样。采用辣椒质控样(TMQC0006,北京坛墨质检科技有限公司)作为本实验标准样品,用于保证方法的准确性。
1.2 氟的测定
根据国家标准《食品中氟的测定》(GB/T 5009.18—2003)[25],采用高温热水解离子选择电极法使用氟离子电极(perfectIONTM,Mettler Toledo,瑞士)测量辣椒样品中氟含量,对每个样品进行3次重复,标准物质的回收率为90%～110%,仪器检测限0.02 mg·L-1。
1.3 生物可给性测定方法
除特别说明,实验所用到的化学物质为分析纯,均购自Sigma-Aldrich公司。采用由Ruby等[20]提出PBET体外消化模型模拟样品胃肠消化过程,对样品胃、小肠2个阶段消化液进行各元素的测定。具体步骤如下。
胃阶段:称取1.0 g样品于50 mL离心管中,加入10 mL模拟胃液(1.25 g·L-1胃蛋白酶、0.5 g·L-1苹果酸钠、0.5 g·L-1柠檬酸钠、420 μL·L-1乳酸、500 μL·L-1醋酸,20%盐酸调pH至1.5),用数显pH计(PHS-25型,雷磁,中国上海)进行pH测定。将该混合液置于37 ℃恒温水浴箱(WYC-4030F型,喆图,中国上海)中震荡2 h(n=100 r·min-1,r=13 cm)。每个样品设置一个平行,每次试验添加2个空白。
肠阶段:待胃阶段消化结束后,向离心管中加入10 mL模拟肠液(0.5 g·L-1胰酶、1.75 g·L-1胆盐),混合后用饱和NaHCO3调节pH至7.0,将该混合液置于37 ℃恒温水浴箱中震荡4 h(n=100 r·min-1,r=13 cm)。用20%盐酸(V∶V)或饱和NaHCO3调节pH,使其保持7.0不变。最后将离心管取出以(n=4 500 r·min-1,r=13 cm)离心15 min,取上清液过0.45 μm滤膜,取滤液于4 ℃保存待测。用氟离子选择电极(perfectIONTM,Mettler Toledo,瑞士)进行氟检测。胃、肠阶段生物可给性计算公式如下[26]:
VBA=(CIV×VIV)/(Cs×Ms)×100%
(1)
式中:VBA为辣椒中氟在胃阶段或肠阶段的生物可给性;CIV为PBET实验胃液或者肠液中所测的元素浓度(mg·kg-1);VIV为消化液的体积(L);Cs为样品元素的总量(mg·kg-1);Ms为样品的质量(kg)。
1.4 消化液中辣椒氟的测定
称取样品于50 mL离心管中,如1.3所述。待消化结束后,胃、肠阶段分别加入25 mL总离子缓冲调节剂(上海雷磁),加一级水(ATSgenc1810Apro,安特生纯水机,中国重庆)使总体积为50 mL。采用氟离子电极(perfectIONTM,Mettler Toledo,瑞士)进行3次测定,该方法最低检出限为0.05 mg·kg-1。
1.5 样品胃肠消化阶段氟化物总溶出量计算方法
样品胃肠消化阶段氟化物总溶出量的计算公式如下:
总溶出量=胃阶段溶出量+肠阶段溶出量
(2)
式中:总溶出量为辣椒样品于胃肠阶段消化后氟化物溶出浓度之和(mg·kg-1);胃阶段溶出量为辣椒样品胃阶段消化时氟化物溶出浓度(mg·kg-1);肠阶段溶出量为辣椒样品肠阶段消化时氟化物溶出浓度(mg·kg-1)。
1.6 含氟化物辣椒最大日摄入量推导方法
以采用US EPA提出的目标危害系数(THQ)不引起健康风险(THQ<1)为基准,食用燃煤烘烤辣椒最大日摄入量计算公式如下:
ADI=THQ×RfD
(3)
IR=(ADI×BW×AT)/(C×EF×ED)
(4)
式中:ADI为慢性每日摄入量(mg·kg-1·d-1),C为辣椒中氟的浓度或胃肠阶段的总氟浓度(mg·kg-1),EF表示暴露频率(365 d·a-1),ED为持续暴露时间(a),AT为平均暴露时间(ED×365) d,BW为平均体质量,RfD为污染物暴露参考剂量(mg·kg-1·d-1),IR就是需要推导最大日摄入量(kg·d-1)。依照US EPA氟的RfD为0.06 mg·kg-1·d-1[27],其余取值见表1。
表1 健康风险评价参数取值[28-31]
Table 1 Values of health risk assessment parameters[28-31]
人群Population平均体质量/kgMean body mass/kg平均暴露时间/dMean exposure time/d持续暴露时间/aDuration of exposure/a儿童Children25.92 1909成年男性Adult male69.610 68070成年女性Adult female5910 68070
1.7 数据处理
本研究实验数据采用Excel 2019整理数据与制表,SPSS 22.0数据统计和相关性分析,OriginPro 2020软件进行回归分析和作图。组间比较采用随机区组设计方差分析,相关性采用Spearman相关分析,检验水准α=0.05。
2 结果(Results)
2.1 辣椒氟含量与烘烤时间的关系
各组辣椒中氟浓度由图1所示。对照组与《食品中污染物限值》(GB 2762—2005) (1.0 mg·kg-1)[32]限值没有差异(P>0.05),燃煤烘烤组辣椒样品中氟浓度均高于标准限值(P<0.01)。辣椒样品氟浓度为1.74～94.7 mg·kg-1,各组辣椒氟浓度大小为30 d(91.25 mg·kg-1)>25 d(70 mg·kg-1)>20 d(51.65 mg·kg-1)>15 d(43.3 mg·kg-1)>10 d(33.07 mg·kg-1)>5 d(23.69 mg·kg-1)>对照组(1.79 mg·kg-1)(P<0.05)。辣椒氟浓度与烘烤时间呈正相关(r=0.992,P<0.01)。结果表明,辣椒在燃煤烘烤过程中会发生氟的富集。
图1 燃煤烘烤时间与辣椒中氟浓度的关系
Fig. 1 The relationship between baking time of coal burning and fluorine concentration in pepper
使用回归模型分析,辣椒中氟浓度(y) (mg·kg-1)与燃煤烘烤时间(x)(d)多项式拟合度最好,回归方程为y=2.140x+0.019x2+6.784,R2=0.975,F=761.180,P<0.001,与显著水平(α=0.05)比较可知回归方程是显著的。回归模型决定系数(R2)接近1,表明建立的多项式回归模型具有良好的回归效果。
2.2 胃肠阶段氟实际溶出量与烘烤时间的关系
如图2所示,各组辣椒氟溶出量均不相同。0～30 d辣椒样品中氟总溶出量与烘烤时间呈正相关关系(r=0.958,P<0.01),均值范围为1.37～67.43 mg·kg-1,占各辣椒氟化物总量(69.91±6.73)%。如图3所示,肠、胃溶出量与烘烤时间呈正相关关系(r=0.951,P<0.01;r=0.949,P<0.01),均值范围分别是0.19～17.46 mg·kg-1、1.17～50 mg·kg-1。胃阶段溶出量与肠阶段溶出量也呈正相关关系(r=0.960,P<0.01)。结果说明,辣椒中的氟在胃肠消化过程中不能完全被释放,溶出量随着烘烤时间增加而增加。
图2 胃、肠消化过程中实际可利用的氟浓度
Fig. 2 Actual available fluoride concentration in the process of stomach and intestine digestion
图3 胃阶段(a)、肠阶段(b)和总溶出(c)氟含量与燃煤烘烤时间及胃肠氟溶出量(d)之间的相关性
Fig. 3 Correlation between fluorine content in gastric stage (a), intestinal stage (b) and total dissolution (c) and coal roasting time and gastrointestinal dissolution (d)
2.3 不同烘烤时间胃、肠消化阶段辣椒中氟的生物可给性分析
如图4所示,模拟胃液中辣椒生物可给性范围是49.65%～65.46%,对照组与烘烤组之间没有差异(P>0.05)。相对于胃阶段,肠阶段辣椒中氟的生物可给性(10.9%～17.32%)平均降低了(37.27±6.74)%,对照组与烘烤组之间没有差异(P>0.05)。肠阶段辣椒中氟的生物可给性(19.3%)均小于胃阶段(53.46%) (P<0.01)。结果说明,辣椒中氟在胃阶段生物可给性高于肠阶段,但生物可给性不受燃煤烘烤时影响。
图4 辣椒中氟在不同消化阶段的生物可给性
Fig. 4 Bioavailability of fluorine in pepper at different digestion stages
2.4 不同人群健康风险阈值
将表2中经生物可给性校正氟浓度代入健康风险评估模型,可以得出各人群食用同一时间燃煤烘烤辣椒健康风险阈值(最大日摄入量),排序为儿童<成年女性<成年男性,见表3。基于生物可给性,各人群最大日摄入量大于直接使用辣椒中氟浓度最大日摄入量。燃煤烘烤时间与各人群最大日摄入量呈显著负相关关系(r=-1,P<0.01)。此外,辣椒中氟浓度越高,人群最大日摄入量呈显著负相关关系(r=-1,P<0.01)。儿童、成年男性和成年女性不发生健康风险前提下,每天食用燃煤烘烤30 d辣椒应不超过16.45、27.84、23.51 g·d-1,较对照组减少了88.34%。结果表明,随着燃煤烘烤时长和辣椒氟含量增加,人群最大日摄入量越小。
表2 不同烘烤时间辣椒中氟浓度和生物可给性校正氟浓度
Table 2 Fluorine concentration in pepper and actual available fluorine concentration in different baking time
燃煤烘烤时间/dCoal-fired baking time/d辣椒中氟浓度/(mg·kg-1)Fluorine concentration in pepper/(mg·kg-1)生物可给性校正氟浓度/(mg·kg-1)Bioavailability corrected fluoride concentrations/(mg·kg-1)01.791.37523.6916.341033.0722.821543.3029.872051.6535.642570.0048.303091.2562.96
表3 食用燃煤烘烤后富氟辣椒的健康风险阈值
Table 3 Health risk thresholds for fluoro-rich peppers after consuming coal-fired roasting (g·d-1)
煤烘烤时间/dCoal-fired baking time/d基于辣椒中氟浓度Based on the fluorine concentration in pepper基于生物可给性校正氟浓度Based on bioavailability corrected fluoride concentrations儿童Children成年男性Adult male成年女性Adult female儿童Children成年男性Adult male成年女性Adult female0577.70977.51825.28141.14238.83201.63543.7474.0162.4863.39107.2690.551031.3352.9244.7545.4076.8264.861523.9340.4234.1834.6858.6849.542020.0633.8828.6629.0749.1941.532514.8025.0021.1421.4536.2930.643011.3519.1816.2216.4527.8423.51
3 讨论(Discussion)
燃煤型地氟病是我国特有的健康问题,食用燃煤烘烤的高氟食物是导致贵州西部燃煤型氟中毒主要途径之一[33-34]。燃煤型地氟病病区由于受气候、经济和农产品收获季节的影响,健康意识淡薄的居民常用敞煤烘烤方式干燥秋季收获的辣椒,燃煤烘烤辣椒会导致辣椒富集大量氟化物,摄入后可能造成人体健康风险[35-37]。本文燃煤烘烤辣椒氟浓度为23.69～94.7 mg·kg-1,较对照组增加了13倍～51倍。邓春元等[38]调查云南省镇雄县氟中毒区辣椒含氟量,发现烘烤4个月辣椒氟浓度(179.36～226.07 mg·kg-1)增加了53倍～66倍,与本研究的结果较为一致。雒昆利等[13]调查贵州燃煤型氟中毒重病区人群摄氟途径,发现燃煤烘烤玉米氟浓度一般增加10倍以上;辣椒比玉米容易氟富集,烘烤后最高会增加100倍。此外,燃煤烘烤辣椒含氟量与燃料中氟的释放率有关。刘文冬等[10]调查贵州省纳雍县新镇4个贫困村寨,发现居民使用拌泥煤烘烤辣椒后其氟浓度最高可达1 273.92 mg·kg-1,较本研究高很多,这可能是与本研究使用的燃料不同。研究发现含水量较高的拌泥煤每千克氟的释放率(66.31%)高于蜂窝煤(43.76%),拌泥煤燃烧过程中产生的水蒸气使氟化物热分解温度降低,从而提高氟析出率[39]。虽然影响辣椒中氟污染的因素很多,但燃煤烘烤会导致辣椒氟富集。
食物中的氟化物在胃肠消化后溶出,溶出后的氟化物通过小肠壁到达机体内循环从而对人体产生危害[40]。辣椒中的氟进入到胃后,在胃中大量溶解成离子状态,胃内溶出的氟并不能完全被完全吸收,小肠消化过程中大约有占氟总量70%～75%会被人体吸收[41],与本研究辣椒氟实际可吸收量(64%～83%)结果相一致。由于胃中OH-浓度较高,辣椒中氟进入胃后产生大量游离态氟,没有被胃吸收的部分进入小肠,随着pH改变可能会转化为不可利用状态,从而导致胃、肠阶段生物可给性的差异[41]。如本研究结果所示(图2),辣椒中氟生物可给性肠阶段(19.3%)低于胃阶段(53.46%),这与刘霞等[15]研究蔬菜中氟生物可给性肠阶段(23.64%)低于胃阶段(44.08%)结果相符合。本研究还发现辣椒氟的生物可给性与辣椒中氟化物浓度不相关。张洁等[42]研究马铃薯中镉的生物可给性时,发现马铃薯中镉污染程度与镉生物可给性呈正相关,说明食物基质和污染物会影响生物可给性。此外,氟化物的生物可给性也受食物营养成分的影响,研究发现牛奶或含钙高的食物中Ca2+与氟化物发生拮抗作用,导致人体内氟化物的生物利用度降低[43-44]。由于影响食物生物可给性因素较多,研究食物中元素的生物可给性以提高健康风险评价的精确度显得尤为重要。
现有的风险评估方法大多使用目标元素总量,但研究表明基于生物可给性进行健康风险评价能更准确评估人群暴露剂量,更准确预测健康危害程度[45-46]。本研究基于辣椒中氟的生物可给性推导出人们食用含不同浓度氟化物辣椒的指导剂量。中国人群暴露参数手册中(成人卷与儿童卷)儿童、成年男女性每天食用辣椒量分别为5 g和9 g,若使用回归模型估算相当于儿童、成年男性食用燃煤烘烤大约75 d(273.6 mg·kg-1)的辣椒会产生健康风险,成年女性食用燃煤烘烤大约60 d(203.22 mg·kg-1)会产生健康风险。李达圣等[47]调查发现贵州省23个燃煤型氟中毒病区人们每天食用辣椒为20 g,人们食用燃煤烘烤30 d(91.25 mg·kg-1)的辣椒可能存在健康风险。这可以解释人群最大摄入剂量随着辣椒氟浓度升高而降低。学者还发现部分燃煤型氟中毒地区蔬菜食用量少而辣椒食用量多,导致每日摄氟量增加氟中毒病情加重[48]。以上仅将辣椒作为唯一摄氟来源,但日常生活中氟暴露来源有很多,除了蔬菜(辣椒等)摄入量外还包括主食、饮水、空气[49-50],共同组成人群总摄氟量。因此,人们每日食用含氟化物辣椒量应比本文最大日摄入量更低。本文研究结果也印证了避免燃煤烘烤是防治燃煤型氟中毒的核心问题,通过改炉改灶降低氟污染是关键措施,减少居民氟暴露是消除燃煤型氟中毒的指导原则。
综上,辣椒中氟生物可给性不受烘烤时间影响,但随着燃煤烘烤时长增加其氟化物含量增高,胃肠阶段的溶出量相应增加,而人群健康风险阈值需减小才不会发生健康风险。
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