自20世纪90年代以来,以非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)为代表的代谢性疾病发病率急剧上升,而NAFLD的相关机制目前仍不清楚,大多数研究都集中在高热量饮食和不健康的生活方式上;然而,环境因素显然也起着重要作用[1]。最近的实验、临床和流行病学研究表明,食物中的污染物可能会对内分泌和代谢功能产生负面影响,从而促进NAFLD和其他相关代谢疾病[2]。在代谢性疾病发病率快速上升之前,以双酚A(BPA)为代表的合成化学品的种类和用量呈指数级增长[3]。但由于其内分泌干扰性质可能对人体健康产生危害,BPA在2017年被欧盟列为高度关注的物质[4]。为了满足工业化学品市场需求,BPA替代品的生产和使用迅速增长,这些物质主要是双酚AF(BPAF)、双酚S(BPS)、双酚F(BPF)[5]。
BPAF是一种模拟雌激素作用的环境内分泌干扰物,已被证明有内分泌干扰、神经毒性、生殖与发育毒性等作用[6-8]。在生产和使用过程中,BPAF容易释放和溶出进入环境中,导致几乎所有环境介质中均可以检测出BPAF的存在,例如地表水、污泥、室内积尘等[9]。在2017—2019年对于各国灰尘中BPA浓度调查中,我国灰尘中BPA最高检出浓度高达37 000 ng·g-1,并且高于其他国家[10]。此外,人们日常广泛使用的日用品都存在着BPAF浸出现象,以至于其可以通过饮食饮水的方式在不经意间使人体暴露,从而危害人体健康,因此在普通人的血浆、尿液、甚至母乳中可以检测出其存在[11-13]。Li等[14]对中国孕妇血清样本进行双酚类似物相关的检测,发现10种双酚类似物包括BPS、BPF、BPAF等都有不同程度的检出,说明双酚类似物已经通过不同途径进入人体内,并对环境和人体构成潜在的威胁。最近一项研究表明,Chen等[15]对斑马鱼进行了7 d胚胎毒性实验,发现BPAF可以导致肝损伤和线粒体介导的细胞凋亡,表明BPAF可能不是安全的BPA替代物。此外,Meng等[16-17]发现围产期BPAF暴露会严重干扰雌性后代肝脏内葡萄糖稳态和脂质代谢,但并不会引起雄性后代肝脏内氧化损伤以及脂质代谢紊乱;然而成熟期暴露BPAF是否会导致小鼠肝脏出现氧化损伤以及脂质代谢紊乱受到越来越多的关注。
在常见的双酚类似物中,尽管BPAF在环境、食品和生物样本中的检出浓度比BPA稍低,但许多研究表明,BPAF表现出比BPA和其他替代品更强的毒性作用和内分泌干扰能力,这表明BPAF的健康危害即使在低水平也应该得到足够的重视[6,18]。本研究对小鼠进行BPAF染毒10周,深入研究不同BPAF浓度染毒对于小鼠肝脏内脂质代谢紊乱的影响。将揭示BPAF影响小鼠肝脏内脂质代谢的相关分子机制,并为临床制定有效的预防措施提供参考。
1 材料与方法(Materials and methods)
1.1 主要仪器与试剂
试剂:双酚AF(纯度99.0%,购于湖北云镁科技有限公司),玉米油、苏木精-伊红(HE)染色液、甘油三酯试剂盒、总胆固醇试剂盒、低密度脂蛋白试剂盒、高密度脂蛋白试剂盒、丙二醛测定试剂盒、谷丙转氨酶测试盒、谷草转氨酶测试盒、还原性谷胱甘肽测试盒、活性氧测试盒购于南京建成生物工程研究所,RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
仪器:超低温高速离心机(Microfuge 22R,Beckman Coulter,USA)、PCR扩增仪(iQ5 Multicolor,Bio-Tek,USA)、PCR测定仪(NANODROP 2000c,Bio-Tek,USA)、光学显微镜(U-RFL-T,Olympus,日本)。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组和染毒
本实验将50只8周龄的SPF级昆明雄性小鼠(Kunming小鼠, KM小鼠)随机分为5组:对照组、溶剂对照组、3组BPAF染毒组(低剂量组、中剂量组、高剂量组)。将BPAF用玉米油溶解后,配成浓度分别为5、20、50 mg·kg-1的含药溶液;低、中、高剂量组每日分别给予5、20、50 mg·kg-1(以体质量计)的BPAF(溶于玉米油),经口灌胃染毒,而对照组和溶剂对照组每日分别给予等体积的生理盐水、玉米油灌胃处理,连续灌胃10周。
1.2.2 血清生化指标检测
染毒结束前1 d,各组小鼠进行禁食过夜,对各组小鼠进行眼眶取血,室温放置30 min后离心20 min,使用移液枪分离出小鼠血清;立即使用全自动生化仪检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)、天门冬氨酸基转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转氨酶(ALT)等指标。
1.2.3 肝组织内脂质水平及氧化应激指标检测
取血成功后,使用颈椎脱臼法处死小鼠,取出小鼠肝组织,称肝组织质量,使用预冷的生理盐水清洗残血;使用剪刀将肝组织加入预冷的生理盐水研磨,制备10%的匀浆,离心取上清液。蛋白定量法测定蛋白浓度后,根据试剂盒说明书检测匀浆中TC、TG、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)。
1.2.4 肝脏组织病理学观察
肝脏组织用10%中性福尔马林溶液固定,常规脱水后石蜡包埋制备4 μm切片,苏木精-伊红染色后,在显微镜下观察其病理学变化。
1.2.5 普鲁士蓝染色检测肝脏中铁沉积
取1.2.4中样品制作石蜡切片,常规脱蜡、水化,冲洗2次后,用普鲁士蓝染色液浸染1 h,再次冲洗3 min后,用核固红试剂染核8 min,再次冲洗3 s,封片,光学显微镜下观察并拍照。每张切片随机选取5个视野进行图像分析,测量普鲁士蓝染色阳性面积占整个面积的百分比。
1.2.6 Western blot检测肝组织Nrf2、HO-1、Gpx4和PPARγ蛋白的表达
剪取肝脏组织并加入蛋白裂解液,研磨棒充分研磨后置于冰上30 min,4 ℃、13 684 ×g离心10 min,取上清测定蛋白浓度。取适量蛋白加入SDS-PAGE上样缓冲液混匀,100 ℃变性5 min。按照上样量算出各组样本上样体积进行电泳并恒压湿转至PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭1 h。孵育Ⅰ抗过夜,TBST洗膜3次后,加入对应Ⅱ抗,孵育1 h;重复洗膜步骤,ECL化学发光显色,分析灰度值,以GAPDH为内参,分析膜上蛋白质表达水平。
1.2.7 RT-PCR法检测肝组织中Nrf2、HO-1、Gpx4和PPARγ mRNA表达水平
将肝脏组织剪成小块,采用离心柱法提取总RNA,严格按照说明书的步骤进行。再转录成cDNA后加入扩增反应体系运用RT-qPCR法扩增,实验结束后采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,序列如表1所示。
表1 实时荧光定量PCR所用引物序列
Table 1 Primer sequences used for real-time qPCR
基因Gene序列(5’～3’)Sequence (5’～3’)PPARγF: TTGCTGAACGTGAAGCCCATR: TGGCGAACAGCTGAGAGGACNrf2F: CTTTAGTCAGCGACAGAAGGACR: AGGCATCTTGTTTGGGAATGTGHO-1F: AGACCGCCTTCCTGCTCAACATR: TCTGACGAAGTGACGCCATCTGTGpx4F: CCACGCAGCCGTTCTTATR: GAGGCAGGAGCCAGGAAGTGAPDHF: ACAACTTTGGTATCGTGGAAGGR: GCCATCACGCCACAGTTTC
1.3 统计分析
实验所得数据均以均数±标准差(mean±SD)表示,采用GraphPad Prism和SPSS 26.0软件进行分析,数据进行正态性检验,正态分布数据采用
表示,并采用单因素方差分析(ANOVA),组间比较采用LSD法,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果(Results)
2.1 小鼠给药前后体质量和肝脏系数
各组小鼠体质量和肝组织的脏器系数如表2所示,与对照组比较,BPAF染毒组给药后体质量显著升高(P<0.05、P<0.01);与溶剂对照组比较,BPAF染毒组给药后体质量升高(P<0.05);BPAF染毒组肝脏指数随着染毒剂量呈升高趋势,但并无统计学意义。
表2 各组小鼠给药前后体质量和肝脏系数
Table 2 Pre- and post-administration body mass and liver coefficients of mice in each group (n=10, 
给药前体质量/gBody mass before treatment/g给药后体质量/gBody mass after treatment/g肝脏系数/%Liver coefficient/%对照组 Control group22.39±1.5740.44±3.523.34±0.47溶剂对照组 Solution control group22.54±1.5640.42±3.513.56±0.32低剂量组 Low-dose group21.96±1.9145.22±4.01&*4.01±0.22中剂量组 Medium-dose group23.54±1.1846.24±3.97#*4.07±0.35高剂量组 High-dose group23.48±2.5948.92±5.36#*4.11±0.24
注:经ANOVA检验,溶剂对照组和双酚AF(BPAF)染毒组与对照组比较,&P<0.05, #P<0.01;对照组和BPAF染毒组与溶剂对照组比较,*P<0.05。
Note: After ANOVA test, the solution control group and bisphenol AF (BPAF) infected group were compared with the control group, &P<0.05, #P<0.01; the control group and the BPAF infected group were compared with the solution control group, *P<0.05.
2.2 各组小鼠血脂和肝功能水平的比较
各组小鼠血脂和肝功能水平如表3所示,与对照组比较,BPAF染毒组血清中TG、TC、LDL、AST、ALT水平显著升高,HDL显著降低(P<0.05, P<0.01);与溶剂对照组比较,BPAF染毒组血清中TG、TC、LDL、AST、ALT水平升高,HDL降低(P<0.05)。
表3 各组小鼠血脂水平
Table 3 Blood lipid levels of mice in each group (n=10,
总胆固醇(TC)/(mmol·L-1)Total cholesterol (TC)/(mmol·L-1)甘油三酯(TG)/(mmol·L-1)Triglyceride (TG) /(mmol·L-1)高密度脂蛋白胆固醇(HDL)/(mmol·L-1)High density lipoprotein cholesterol (HDL)/(mmol·L-1)低密度脂蛋白胆固醇(LDL)/(mmol·L-1)Low density lipoprotein cholesterol (LDL)/(mmol·L-1)天门冬氨酸基转氨酶(AST)/(U·L-1)Aspartate aminotransferase (AST)/(U·L-1)丙氨酸氨基转氨酶(ALT)/(U·L-1)Alanine aminotransferase (ALT)/(U·L-1)对照组Control group1.56±0.630.65±0.471.24±0.440.72±0.1756.19±10.7447.72±2.02溶剂对照组Solution control group1.49±0.850.73±0.341.32±0.240.76±0.3354.99±9.547.92±3.02低剂量组Low-dose group2.46±0.58#*1.43±0.32#*0.63±0.31#*1.47±0.56#*69.17±6.23#*75.76±8.56#*中剂量组Medium-dose group2.52±0.73#*1.48±0.21#*0.61±0.36#*1.48±0.47#*82.6±4.93#*80.37±7.6#*高剂量组High-dose group2.79±0.69#*1.56±0.19#*0.59±0.39#*1.76±0.31#*96.04±9.77#*83.3±9.29#*
注:经ANOVA检验,溶剂对照组和BPAF染毒组与对照组比较,#P<0.01;对照组和BPAF染毒组与溶剂对照组比较,*P<0.05。
Note: After ANOVA test, the solution control group and BPAF infected group were compared with the control group, #P<0.01; the control group and the BPAF infected group were compared with the solution control group, *P<0.05.
2.3 肝组织氧化损伤及肝脂质指标检测
各组小鼠肝组织氧化应激指标水平如表4所示,与对照组比较,BPAF染毒组TC、TG、ROS、MDA水平显著升高,GSH显著降低(P<0.05,P<0.01);与溶剂对照组比较,BPAF染毒组TC、TG、ROS、MDA水平升高,GSH降低(P<0.05)。
表4 各组小鼠肝组织氧化应激指标水平
Table 4 Levels of oxidative stress indexes in liver tissues of mice in each group
丙二醛(MDA)/(μmol·g-1)Malondialdehyde (MDA)/(μmol·g-1)活性氧(ROS)/(fluorescence intensity·mg-1)Reactive oxygen species (ROS)/(fluorescence intensity·mg-1)还原型谷胱甘肽(GSH)/(mg·g-1)Reduced glutathione (GSH)/(mg·g-1)TC/(mmol·L-1)TG/(mmol·L-1)对照组Control group1.73±0.6439.92±12.784.46±0.262.68±0.40.76±0.2溶剂对照组Solution control group1.71±0.4739.52±11.044.48±0.242.71±0.380.77±0.21低剂量组Low-dose group3.07±0.08#*62.14±17.61#*3.89±0.26#*4.79±0.44#*1.48±0.43#*中剂量组Medium-dose group3.59±0.45#*84.94±17.50#*3.46±0.22#*4.86±0.41#*1.67±0.89#*高剂量组High-dose group4.34±0.53#*93.73±17.72#*3.12±0.25#*6.17±0.08#*3.08±0.18#*
注:经ANOVA检验,溶剂对照组和BPAF染毒组与对照组比较,#P<0.01;对照组和BPAF染毒组与溶剂对照组比较,*P<0.05。
Note: After ANOVA test, the solution control group and BPAF infected group were compared with the control group, #P<0.01; the control group and the BPAF infected group were compared with the solution control group, *P<0.05.
2.4 各组小鼠肝组织病理学变化
HE染色结果如图1所示,对照组和溶剂对照组肝细胞排列整齐,细胞核清晰,胞质完整,肝小叶结构清晰,细胞内并未出现水肿、脂化等异常病理变化,无炎症细胞浸润现象;低剂量BPAF组肝细胞排列较整齐,肝细胞细胞核被挤压至边界,肝细胞脂肪变性明显加重,细胞内可见大小不一的脂滴空泡;中、高剂量组肝细胞排列紊乱,肝小叶结构不清晰,肝细胞细胞核被挤压至边界,肝细胞严重水肿呈气泡样变,且出现大面积脂滴空泡。
图1 各组小鼠肝脏结构的变化(HE, ×400)
注:(a) 对照组;(b) 溶剂对照组;(c) 低剂量组;(d) 中剂量组;(e) 高剂量组;黑色箭头表示脂肪变性,红色箭头表示细胞水肿。
Fig. 1 Changes in liver structure in each group (HE, ×400)
Note: (a) Control group; (b) Solution control group; (c) Low-dose group; (d) Medium-dose group; (e) High-dose group; black arrows indicate steatosis, and red arrows indicate cellular edema.
2.5 各组小鼠肝脏内铁沉积比较
普鲁士蓝染色结果如图2所示,普鲁士蓝阳性面积比如表5所示,对照组、溶剂对照组及BPAF染毒组肝组织内未见明显蓝色染色颗粒,普鲁士蓝染色呈阴性,普鲁士蓝染色阳性面积比呈升高趋势,但未有统计学差异,表明肝细胞内没有铁沉积。
图2 各组小鼠肝组织普鲁士蓝染色图
注:(a) 对照组;(b) 溶剂对照组;(c) 低剂量组;(d) 中剂量组;(e) 高剂量组。
Fig. 2 Prussian blue staining of mouse liver tissue in each group
Note: (a) Control group; (b) Solution control group; (c) Low-dose group; (d) Medium-dose group; (e) High-dose group.
表5 各组小鼠肝组织普鲁士蓝染色阳性面积比
Table 5 Prussian blue staining positive area ratio of mouse liver tissue in each group
普鲁士蓝染色阳性面积比Prussian blue staining positive area ratio对照组Control group0.29±0.05溶剂对照组Solution control group0.28±0.02低剂量组Low-dose group0.30±0.04中剂量组Medium-dose group0.29±0.03高剂量组High-dose group0.27±0.02
2.6 各组小鼠肝组织Nrf2、HO-1、Gpx4、PPARγ蛋白表达的比较
由图3可知,通过对各组小鼠肝组织Nrf2、HO-1、Gpx4和PPARγ蛋白检测发现,与对照组相比,BPAF染毒组肝组织Nrf2、HO-1、Gpx4蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01),PPARγ蛋白表达显著升高(P<0.05,P<0.01);与溶剂对照组相比,BPAF染毒组肝组织Nrf2、HO-1、Gpx4蛋白表达显著降低(P<0.05),PPARγ蛋白表达显著升高(P<0.05)。
图3 各组小鼠肝组织内Nrf2、HO-1、Gpx4、PPARγ蛋白表达
注:经ANOVA检验,溶剂对照组和BPAF染毒组与对照组比较,#P<0.01;对照组和BPAF染毒组与溶剂对照组比较,*P<0.05。
Fig. 3 Nrf2, HO-1, Gpx4, PPARγ protein expression in the liver tissues of mice in each group
Note: After ANOVA test, the solution control group and BPAF infected group were compared with the control group, #P<0.01; the control group and the BPAF infected group were compared with the solution control group, * P<0.05.
2.7 各组小鼠肝组织Nrf2、HO-1、Gpx4、PPARγ基因表达的比较
各组小鼠肝组织内Nrf2、HO-1、Gpx4、PPARγ基因表达如图4所示。与对照组相比,BPAF染毒组肝组织Nrf2、HO-1、Gpx4的mRNA表达显著降低(P<0.05,P<0.01),PPARγ的mRNA表达显著升高(P<0.05,P<0.01);与溶剂对照组相比,BPAF染毒组肝组织Nrf2、HO-1、Gpx4的mRNA表达显著降低(P<0.05),PPARγ的mRNA表达显著升高(P<0.05)。
图4 各组小鼠肝组织内Nrf2、HO-1、Gpx4、PPARγ基因表达
注:经ANOVA检验,溶剂对照组和BPAF染毒组与对照组比较,#P<0.01;对照组和BPAF染毒组与溶剂对照组比较,*P<0.05。
Fig. 4 Nrf2, HO-1, Gpx4, PPARγ gene expression in the liver tissues of mice in each group
Note: After ANOVA test, the solution control group and BPAF infected group were compared with the control group, #P<0.01; the control group and the BPAF infected group were compared with the solution control group, *P<0.05.
3 讨论(Discussion)
BPAF是一种BPA替代物,随着BPAF在日常生活中的广泛应用,可能会蓄积于环境介质和食品介质中,进而对于人体健康及生态环境造成威胁。本研究发现,BPAF对于成熟期雄性小鼠进行长达10周染毒,对小鼠体质量、肝组织结构等都产生了不利的影响,并且其毒性效应与染毒剂量呈正相关。此外,BPAF还能干扰小鼠体内脂质代谢的平衡,影响肝功能指标、血脂指标及氧化应激指标,并提高肝组织内PPARγ的mRNA和蛋白表达,降低肝组织内Nrf2、HO-1、Gpx4的mRNA和蛋白表达,我们推测BPAF染毒导致小鼠肝组织内脂质代谢紊乱可能与氧化应激有关,机制可能与下调Nrf2/HO-1通路有关。
肝脏是维持正常生理功能的关键器官,在解毒和脂质代谢中起着至关重要的作用[19]。肝组织病理学观察结果显示,BPAF染毒组肝组织内出现严重肝组织脂肪变性及部分细胞水肿。小鼠给药前后体质量和肝脏系数结果显示,随着BPAF剂量不断增加,BPAF染毒组小鼠体质量显著升高,而肝脏系数并未出现明显变化。随后,本研究检测了血清内TG、TC、LDL、HDL水平、肝组织内TG、TC水平以及血清内ALT和AST的活性以评估肝损伤。与对照组和溶剂对照组比较,随着BPAF染毒剂量的增加,BPAF染毒组血清中TG、TC、LDL、ALT和AST和肝组织内TG、TC明显升高,血清中HDL明显降低,表明BPAF染毒显著增加了肝组织内脂质积累及肝组织损伤,证实了上述病理学观察结果。随后,本研究对肝组织内关于脂质代谢的调控相关基因PPARγ进行了进一步检测。PPARγ是脂质吸收和合成的关键控制因子,可诱导脂肪细胞分化,促进脂肪形成,提高胰岛素敏感性[20]。近年来研究证明,BPAF在HepG2细胞中反激活PPARγ依赖性报告基因活性,并在人脂肪细胞分化的早期阶段适度刺激PPARγ基因转录[21]。本研究结果显示,BPAF染毒组小鼠肝组织内PPARγ基因和蛋白表达显著升高;表明PPARγ的上调可能与BPAF染毒引起的肝脏脂质代谢紊乱有关,说明PPARγ可能是潜在的参与BPAF诱导肝脏脂质代谢紊乱的关键分子。
氧化应激是指ROS的过度产生,从而导致抗氧化系统功能丧失,在肝脏疾病发展中起关键作用,从脂肪变性到纤维化、肝硬化和肝癌都持续并参与这种病理进展过程[22-23]。过量的ROS可使脂质发生过氧化反应,脂质过氧化反应的主要代谢产物是MDA,其水平的高低代表脂质过氧化的强度;还原型的GSH也可以和ROS结合并通过抗坏血酸-谷胱甘肽循环生成具更强抗氧化作用的抗坏血酸,还原型的GSH是ROS的主要清除剂,其消耗水平能反映机体的受氧化损伤程度。本研究显示,BPAF染毒显著升高了肝组织内ROS、MDA水平,并显著降低了GSH水平;表明BPAF染毒导致小鼠肝脏中脂质过氧化和氧化损伤。随后,本研究对抗氧化通路Nrf2/HO-1是否出现下调进行了进一步研究。Nrf2/HO-1通路是调节氧化-抗氧化轴平衡的重要途径,Nrf2是一种关键的转录因子,可调节细胞的氧化应激,也可以诱导和调节抗氧化蛋白的组成性和诱导性表达,减少ROS引起细胞损伤,也是维持细胞内氧化还原稳态的重要调节剂;当Nrf2受到外界刺激后,Nrf2与抑制蛋白KeaP1解离,从而Nrf2转移到细胞核后,激活下游分子HO-1、Gpx4等,发挥着抗氧化作用[24]。本研究结果显示,BPAF染毒组小鼠肝组织内抗氧化通路Nrf2/HO-1基因和蛋白表达显著升高;表明Nrf2、HO-1、Gpx4的下调与BPAF染毒引起的抗氧化功能降低有关,说明抗氧化通路Nrf2/HO-1是潜在的参与BPAF染毒诱导肝组织发生氧化损伤,从而导致肝组织内出现脂质代谢紊乱的关键分子。
铁死亡是一种铁依赖性脂质ROS的积累,ROS对核酸、蛋白质和脂质膜造成损害,最终导致细胞死亡[25]。Gpx4是一种脂质修复酶,具有清除脂质过氧化物的功能,几乎可作为判断细胞铁死亡的参考标志[26]。本研究显示,经BPAF染毒后小鼠肝组织出现MDA显著升高、GSH显著降低、Gpx4基因和蛋白表达量出现明显降低,然而普鲁士蓝染色阳性面积分析显示各组小鼠肝组织并未出现明显异常,表明BPAF染毒可以诱导肝组织内出现脂质过氧化物积累,但肝组织并未出现铁沉积,说明Gpx4可能由于上游因子Nrf2调控从而导致表达量显著降低,铁死亡并不参与BPAF染毒诱导肝组织发生氧化损伤和脂质代谢紊乱。
综上所述,本研究结果表明BPAF染毒导致小鼠肝组织内脂质代谢紊乱与氧化应激有关,机制与下调Nrf2/HO-1通路有关。然而本研究尚存在一定不足,BPAF是一种公认的环境内分泌干扰物,BPAF是否通过干扰雌激素受体通路从而导致肝组织内脂质代谢紊乱,有待进一步研究。
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