丙烯腈(acrylonitrile, ACN)作为纤维、橡胶和树脂等高分子材料合成中的单体,在工业合成中具有重要地位[1]。在我国ACN生产量大,是备受关注的工业毒物和环境污染物。在厨房橡胶用品、香烟、食品包装和医用塑料材料中均可检测到ACN[2-4]。

在职业、生活和环境中都可以接触到ACN,它可经皮肤、消化道和呼吸道吸收进入人体,吸收后靶器官为肝、肾和脑等。肝脏损伤的机制可能与ACN引起肝组织氧化损伤有关[5];研究报道,PERK/eif2α信号通路激活引起的细胞凋亡可能是ACN导致肝细胞损伤的原因[6]。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinasen B, PI3K/AKT)信号通路激活后可抑制细胞凋亡的发生[7-8],其参与细胞的存活、生长及凋亡等。AKT是PI3K启动子的重要下游因子之一,激活的PI3K可活化AKT,之后通过对下游底物的磷酸化来调控细胞发挥不同的功能[9]。PI3K/AKT信号通路被激活后,磷酸化Bad的丝氨酸残基[10],使其与Bcl-2和Bcl-xL的异源二聚体分离,可抑制细胞凋亡[11-12]。研究表明,活性氧(reactive oxygen species, ROS)在细胞内的增加可激活酪氨酸磷酸酶,使AKT去磷酸化,导致下游的相关蛋白失活,起到促进凋亡的作用[13];同时AKT激活后可以增加ROS的产生[14]。以上研究表明,细胞内ROS的增加可抑制PI3K/AKT信号通路,进一步会激活细胞线粒体凋亡通路。本团队前期研究结果表明,ACN亚急性染毒后,可改变大鼠肝组织脂质过氧化水平,引起肝损伤[15]。

综上,ACN可引起肝组织氧化损伤,而ROS可抑制PI3K/AKT信号通路而进一步激活线粒体凋亡途径引起细胞凋亡,因此,本研究主要探讨PI3K/AKT信号通路在ACN引起的大鼠肝细胞损伤中的作用及机制,为ACN的毒性作用研究提供科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 动物及其分组

60只SD雄性大鼠,体质量180～220 g,SPF级,购自甘肃中医药大学医学动物实验中心,动物合格证编号SCXK(甘)2015-0002,实验设施合格证编号SYXK(甘)2015-0005。大鼠适应性饲养1周后,依体质量随机分成对照组、3个不同剂量ACN染毒组和干预组,每组12只。对照组给予玉米油灌胃,低、中、高剂量染毒组分别给予11.5 mg·kg-1、23.0 mg·kg-1、46.0 mg·kg-1 ACN灌胃,干预组先给予抗氧化剂N-乙酰基半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)300 mg·kg-1灌胃30 min后,再用46.0 mg·kg-1 ACN染毒(文中简称为NAC组)。每只大鼠灌胃容积为5.0 mL·kg-1,每隔2 d称体质量调整灌胃剂量,灌胃1 次·d-1,6 d·周-1,连续28 d。ACN染毒剂量依据本团队前期系列研究设定。研究通过了兰州大学公共卫生学院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂和仪器

ACN(分析纯,纯度>99%,天津凯信,中国),NAC(Amresco, USA),BCA试剂盒(Thermo, USA),BSA、RIPR裂解液和PMSF(北京索莱宝有限公司,中国),彩色蛋白预染Marker(Thermo, USA),ECL发光液(上海碧云天生物科技公司,中国),TUNEL试剂盒(武汉博士德生物有限公司,中国),PI3K一抗(兔抗鼠)、p-PI3K一抗(兔抗鼠)、AKT一抗(兔抗鼠)、p-AKT一抗(兔抗鼠)、Bad一抗(兔抗鼠)、p-Bad一抗(兔抗鼠)(Cell Signalway Technology, USA),Bax一抗(兔抗鼠)、Bcl-2一抗(兔抗鼠)、Caspase-9一抗(兔抗鼠)、HRP标记山羊抗兔二抗、GAPDH一抗(兔抗鼠)(Signalway Antibody, USA),Cyt c一抗(兔抗鼠)、Caspase-3一抗(兔抗鼠)(Cell Signalway Technology, USA),Trizol试剂(Thermo, USA),cDNA反转录试剂盒、PCR扩增试剂盒(TaKaRa, Japan),PI3K、AKT、Bad、Bcl-2、Caspase-9、Cyt c和Caspase-3引物(TaKaRa, Japan),DEPC(Sigma, USA)。超低温高速离心机(Microfuge 22R,Beckman coulter, USA),电泳仪及凝胶成像系统(ChemiDoc XRS+,Bio-Tek, USA),PCR扩增仪(iQ5 Multicolor,Bio-Tek, USA),PCR测定仪(NANODROP 2000c,Bio-Tek, USA),光学显微镜(U-RFL-T,Olympus, Japan)。

1.3 TUNEL法检测大鼠肝细胞的凋亡水平

取肝组织切片脱蜡、水化后,蛋白酶K 37 ℃消化10 min,TBS洗3次。加封闭液,37 ℃放置30 min。加生物素化抗地高辛抗体,37 ℃放置30 min,TBS洗3次。加SABC,37 ℃放置30 min,TBS洗4次。DAB显色,水洗,苏木素轻度复染后,水洗,烘干,封片。光学显微镜下观察细胞凋亡情况,方法细节详见文献[16]。

1.4 qRT-PCR检测mRNA表达

切取肝组织70～100 mg,加4 ℃预冷Trizol液,震荡30 s,-80 ℃冰箱过夜。研磨样品,加4 ℃预冷氯仿,剧烈震荡15 s,4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min,留上清,取350 μL,加入4 ℃预冷异丙醇,震荡,静置10 min,4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min,弃上清。白色沉淀中加入用0.1% DEPC配制的75%乙醇,摇匀,4 ℃、7 500 r·min-1,离心5 min,弃上清。沉淀物中加入4 ℃预冷0.1% DEPC水,摇匀。取1 μL,选择A260/A280的比值在1.8～2.2之间的样品进行反转录实验,剩余样液用0.1% DEPC水稀释备用,方法细节详见文献[16]。

选择20 μL反转录体系,反录条件为:37 ℃、15 min,85 ℃、5 s。得到cDNA模板,-80 ℃冰箱保存备用。扩增体系选定为25 μL,引物如表1所示。PCR反应:95 ℃预变性30 s→95 ℃变性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,共50个循环→60 ℃熔解15 s,共71个循环。采用Pfaffl法分析目的基因mRNA的相对表达。

计算公式如下:

扩增效率:E=(Rn,A/Rn,B)1/(Ct,A-Ct,B)-1

式中:A、B表示在扩增曲线上任意选取的2个点;Rn,A、Rn,B为A、B这2点对应的荧光值;Ct,A和Ct,B为A、B这2点对应的Ct值。

mRNA相对表达水平:Ratio=E1△Ctl/E0△Ct0

式中:ΔCt1表示对照组目的基因与实验组目的基因的Ct值之差;ΔCt0表示对照组内参基因与实验组内参基因的Ct值之差;E1表示目的基因的扩增效率;E0表示内参基因(β-actin)的扩增效率。

1.5 Western Blot法检测蛋白表达

取大鼠肝组织100～200 mg,按肝脏湿质量(g)∶RIPA裂解液(mL)为1∶10加入对应体积经4 ℃预冷的RIPA裂解液,冰水浴研磨成匀浆;4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min,留上清。将蛋白浓度定为4 μg·μL-1,密封,煮沸5 min,取出冷却后置-80 ℃冰箱备用,方法细节详见文献[16]。

通过制胶→SDS-PAGE凝胶电泳→转膜→封闭→一抗孵育→二抗孵育→曝光,保存目的蛋白条带。用Image J分析软件(美国NIH公司)进行灰度分析,公式如下:

目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值

1.6 统计分析

采用SPSS 22.0(美国IBM公司)进行实验结果分析。结果以表示,用单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差齐用LSD-t检验,方差不齐用Dunnett’ T3检验,检验水准α=0.05。

2 结果(Results)

2.1 TUNEL法检测大鼠肝细胞的凋亡

如图1所示,ACN低、中剂量组凋亡细胞较多。ACN低、中剂量组凋亡细胞数较对照组显著增多(P<0.05);NAC组与ACN高剂量组相比凋亡细胞数无显著差异(P>0.05)。

2.2 ACN对大鼠肝脏PI3K/AKT信号通路的影响

2.2.1 ACN对大鼠肝脏PI3K/AKT通路相关基因的影响

如图2所示,mRNA相对表达水平检测结果显示,ACN中、高剂量组较对照组pi3k表达水平显著降低(P<0.05);akt表达水平ACN各剂量组间的差异无统计学意义(P>0.05)。pi3k和akt表达水平NAC组与ACN高剂量组相比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2.2 ACN对大鼠肝脏PI3K/AKT通路相关蛋白的影响

免疫印迹法(WB)测定蛋白相对表达水平,如图3所示,PI3K表达水平ACN中剂量组较对照组显著降低(P<0.05);p-PI3K、p-AKT表达水平ACN高剂量组较对照组显著降低(P<0.05)。AKT表达水平ACN各剂量组间的差异无统计学意义(P>0.05)。PI3K表达水平NAC组与ACN高剂量组相比较显著升高(P<0.05)。

2.3 ACN对大鼠肝细胞凋亡的影响

2.3.1 ACN对大鼠肝细胞凋亡相关基因的影响

mRNA相对表达水平检测结果如图4所示,bad、caspase-3表达水平ACN低剂量组较对照组显著升高(P<0.05),bcl-2表达水平ACN低剂量组较对照组水平显著降低(P<0.05);cyt c表达水平ACN中剂量组较对照组显著升高(P<0.05),bcl-2表达水平ACN中剂量组较对照组显著降低(P<0.05);bad表达水平ACN高剂量组较对照组显著升高,bcl-2表达水平ACN高剂量组较对照组显著降低(P<0.05)。bad表达水平NAC组较ACN高剂量组显著降低(P<0.05)。

2.3.2 ACN对大鼠肝细胞凋亡相关蛋白的影响

WB测定蛋白相对表达水平结果如图5所示,pro-Caspase-3表达水平ACN低剂量组较对照组显著降低(P<0.05),cleaved-Caspase-3表达水平ACN低剂量组较对照组显著升高(P<0.05);p-Bad、pro-Caspase-3表达水平ACN中剂量组较对照组显著降低(P<0.05),Bad、Bax和Caspase-9、Cyt c表达水平ACN中剂量组较对照组显著升高(P<0.05),Bcl-2/Bax值ACN中剂量组较对照组显著降低(P<0.05);p-Bad、Bcl-2和pro-Caspase-3表达水平ACN高剂量组较对照组显著降低(P<0.05),Bad、Bax、Caspase-9、Cyt c和cleaved-Caspase-3表达水平ACN高剂量组较对照组显著升高(P<0.05),Bcl-2/Bax值ACN高剂量组较对照组显著降低(P<0.05)。p-Bad、pro-Caspase-3表达水平NAC组较ACN高剂量组显著升高(P<0.05),Bax、Caspase-9和cleaved-Caspase-3表达水平NAC组较ACN高剂量组显著降低(P<0.05)。

3 讨论(Discussion)

3.1 ACN诱导大鼠肝细胞发生凋亡

本研究中,大鼠ACN染毒28 d后,肝细胞凋亡增多。进一步检测发现,与对照组相比较,肝细胞bcl-2 mRNA相对表达水平在ACN低、中、高剂量组都显著降低;bad mRNA相对表达水平在ACN低、高剂量组显著增高;caspase-3 mRNA相对表达水平在ACN低剂量组显著增高;cyt c mRNA相对表达水平在ACN中剂量组显著增高。WB结果显示,与对照组相比较,肝细胞pro-Caspase-3蛋白相对表达水平在ACN低、中、高剂量组都显著降低;cleaved-Caspase-3蛋白相对表达水平在ACN低、高剂量组显著增高;Bad蛋白相对表达水平在ACN中、高剂量组显著增高;Bax蛋白相对表达水平在ACN中、高剂量组显著增高; Caspase-9蛋白相对表达水平在ACN中、高剂量组显著增高;Cyt c蛋白相对表达水平在ACN中、高剂量组显著增高;p-Bad蛋白相对表达水平在ACN中、高剂量组显著降低;Bcl-2蛋白相对表达水平在ACN高剂量组显著降低;Bcl-2/Bax比值在ACN中、高剂量组均显著降低。这说明,ACN可使肝细胞中抑制凋亡的相关因子的表达受到抑制,促凋亡的相关因子表达激活,这与TUNEL检测发现凋亡细胞增多的结果相吻合。但在本实验条件下,不同凋亡相关因子的mRNA相对表达水平和蛋白相对表达水平对ACN剂量的敏感性有所不同。

NAC是氨基酸L-半胱氨酸和谷胱甘肽(GSH)的乙酰化前体物质,其生物活性归因于巯基,与此同时由于乙酰基取代了氨基,其可以清除细胞内ROS。赵乾龙等[17]报道,NAC可通过抗氧化对ACN引起的睾丸细胞损伤有保护作用。张瑞萍等[18]发现NAC干预后可拮抗ACN诱导大鼠脑组织发生氧化应激;罗波艳等[19]报道,NAC可降低ACN诱导的大鼠脑组织氧化应激水平;潘丽等[6]发现NAC干预后可逆转ACN诱导的大鼠肝组织中丙二醛(MDA)含量升高、GSH含量降低和超氧化物歧化酶(SOD)活性降低的变化,一定程度上减轻了肝组织的氧化损伤。本研究中,与ACN高剂量组相比,NAC组bad mRNA相对表达水平显著降低,p-Bad、pro-Caspase-3蛋白相对表达水平显著增高,Bax、Caspase-9和cleaved-Caspase-3蛋白相对表达水平显著降低。这表明NAC给予后对大鼠肝细胞凋亡具有一定的保护作用,进一步验证了氧化应激参与了ACN所致的大鼠肝细胞凋亡。

3.2 PI3K/AKT信号通路在ACN所致大鼠肝细胞凋亡中的作用

Suo等[20]研究发现激活PI3K/AKT通路,Caspase-3的活化可被抑制,可以起到抗氧化和抗凋亡的作用。研究报道,在PI3K/AKT通路中,激活的PI3K可以活化AKT,从而使Bad蛋白磷酸化,Bcl-2、Bcl-xL被释放出或两者结合被阻断并与Bax结合形成二聚体,起到抑制细胞凋亡的作用[21];磷酸化的Bax可以直接与Bcl-2形成二聚体,起到抗凋亡的作用;活化的AKT可使Caspase-9磷酸化,发挥抑制凋亡的作用[22]。

本研究结果显示,与对照组相比,ACN中剂量组pi3k mRNA相对表达水平显著降低,PI3K蛋白相对表达水平显著降低;ACN高剂量组pi3k mRNA相对表达水平显著降低,p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达水平显著降低。这提示中剂量ACN染毒影响了pi3k mRNA和蛋白表达,高剂量ACN染毒影响了pi3k mRNA和p-PI3K、p-AKT蛋白表达;ACN中、高剂量组各指标的变化未同步显示出“一致性”,有待于今后深入研究。NAC组PI3K蛋白相对表达水平较高剂量ACN组显著增高,显示出在给大鼠抗氧化剂处理后,可减轻ACN对PI3K蛋白相对表达水平的抑制。这提示ACN对大鼠肝脏的过氧化使PI3K/AKT信号通路抑制,进而促进了肝细胞的凋亡。

在本实验条件下,大鼠肝组织产生了病理学改变,血清丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶活性升高,肝组织过氧化氢酶活性降低,谷胱甘肽含量降低,丙二醛含量升高。ACN可引起大鼠肝脂质过氧化水平升高,NAC可减轻ACN引起的大鼠肝脏氧化损伤[15]。因此,ACN诱导的氧化应激、PI3K/AKT信号通路的抑制和线粒体凋亡途径的激活可能是ACN致大鼠肝细胞损伤的主要机制。

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Role of PI3K/AKT Signaling in Acrylonitrile-induced Hepatocyte Injury in Rats

Zheng Ai, Zhao Fenxian, Shi Ying, Zheng Rong, Dang Yuhui, Li Zhilan*

School of Public Health, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China

Abstract：To determine how acrylonitrile (ACN) affected the PI3K/AKT signaling in rat hepatocytes, sixty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups: control group, ACN low dose group (11.5 mg·kg-1), ACN medium dose group (23.0 mg·kg-1), ACN high dose group (46.0 mg·kg-1) and intervention group by gavage administered with the volume of 5.0 mL·kg-1 once a day for 6 days a week for a total of 28 days, respectively. One day after the last gavage, rats were anesthetized for blood collection and sacrificed, and livers were harvested for additional assays. (1) Terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling (TUNEL) was used to detect apoptosis; (2) Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction method (qRT-PCR) was employed to examine gene expression of pi3k, akt, bad, bcl-2, cyt c, and caspase-3; (3) Western Blot (WB) was utilized to measure the expression level of protein related to PI3K/AKT signaling pathway and mitochondrial apoptosis pathway. Results indicated: (1) ACN low and medium group present a significant apoptotic phenomenon compared to control group (P<0.05). (2) mRNA level. In the ACN low dose group, bad and caspase-3 were considerably upregulated (P<0.05), while bcl-2 was dramatically downregulated (P<0.05); in ACN medium dose group, pi3k and bcl-2 were decreased (P<0.05), whereas cyt c was increased (P<0.05). In the ACN high-dose group, pi3k and bcl-2 decreased, while bad increased (P<0.05). There was no significant difference in akt between ACN dose groups (P>0.05). bad in N-acetylcysteine (NAC) group was lower than that in ACN high-dose group (P<0.05). (3) Protein level. Compared with the control group, pro-Caspase-3 was decreased and cleaved Caspase-3 was increased in the low-dose ACN group (P<0.05); in ACN medium-dose group, PI3K, p-Bad, pro-Caspase-3 and Bcl-2/Bax were decreased, Caspase-9, Bad, Bax and Cyt c were increased (P<0.05). In the ACN high-dose group, p-PI3K, p-AKT, Bcl-2, p-Bad, pro-Caspase-3 and Bcl-2/Bax were decreased, while Bad, Bax, Caspase-9, Cyt c, cleaved Caspase-3 were increased (P<0.05). There was no significant difference in AKT among the ACN dose groups (P>0.05). Compared with the high-dose ACN group, PI3K, p-Bad and pro-Caspase-3 were increased in the NAC group, while Bax, Caspase-9, and cleaved Caspase-3 were decreased (P<0.05). It is concluded that ACN may induce hepatocyte injury via PI3K/Akt signaling pathway and the activation of mitochondrial apoptosis pathway in rats.

Keywords：acrylonitrile; rats; cell apoptosis; PI3K/AKT signaling pathway; hepatocyte

收稿日期：2022-05-16

录用日期：2022-08-09

文章编号：1673-5897(2023)2-346-10

中图分类号：X171.5

文献标识码：A

第一作者：郑爱(1989—),女,硕士研究生,研究方向为卫生毒理学,E-mail: zhenga16@lzu.edu.cn

*通信作者(Corresponding author), E-mail: lizhl@lzu.edu.cn

DOI： 10.7524/AJE.1673-5897.20220516002

郑爱, 赵粉线, 石影, 等. 丙烯腈致大鼠肝细胞损伤中PI3K/AKT信号通路的作用[J]. 生态毒理学报,2023, 18(2): 346-355

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Received 16 May 2022

accepted 9 August 2022

通信作者简介：李芝兰(1962—),女,学士,教授,主要研究方向为环境与健康。