自2019年12月,新型冠状病毒(COVID-19)疫情暴发以来,由于没有针对COVID-19感染的特定抗病毒治疗药物,大量抗生素、抗病毒药物和杀菌剂被广泛用于治疗与防控新冠疫情,并随着污水出水排放进入受纳水体,在环境中持久存在,进而给水生态和人体健康带来风险[1-2]。目前,疫情期间使用的药物及杀菌剂副产物在全球范围的水环境中有广泛检出。例如,在西班牙河水中的抗病毒药物有较高检出,其中利托那韦会对人类健康造成不利影响[3-4];在全球范围内,疫情期间,地表水中的阿奇霉素浓度从4.3 ng·L-1增加到935 ng·L-1,城市废水中的抗病毒药物浓度增加了70%以上[5]。
这些药品与化学品释放到水环境中,将对水生态环境及人体健康造成不同程度的危害。一方面,氯消毒剂可以通过破坏细胞壁或通过氧化破坏其蛋白质直接伤害生物体,药物能通过食物链放大传递到更高营养级,最终威胁人体健康[1];另一方面,药物中含有的活性物质可能会诱导环境中耐药菌株的选择性增殖,带来生态毒性效应,并增大耐药菌对水生生物与人体的感染风险[6-8];此外,消毒剂中的化学物质会与其他物质结合形成有毒的消毒副产物,例如三卤甲烷、卤乙酸、氯胺和N-亚硝基二甲胺等[9]。因此,新污染物带来的水环境生态效应,引起了研究者的广泛关注。然而,现有关于疫情期间水环境中污染物的浓度分布数据十分有限,且难以从污染物的化学分析推断其生物效应[2,10]。相较于化学分析只能确定排放到环境中的污染物浓度与组成,生物分析可以直观地反映污染物对生物体的危害作用[11-13]。其中,发光细菌毒性检测利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光细菌发光强度的影响,作为一种操作简单、反应快速和灵敏度高的方法,已被广泛应用于环境污染物的急性毒性研究[10-14]。
长江从上游的欠发达地区流向下游的人口密集和经济发达地区,流域面积占中国国土面积的1/5,流域总人口占全国的16%,平均人口密度是全国平均人口密度的4.9倍[15]。因此,长江流域水生态环境保护受到党中央、国务院的高度重视[16]。然而,现有研究多针对疫情暴发后,特定污染物在污水处理厂上下游的浓度分布,缺乏关于疫情对长江流域的生态毒理学评估[5-6,17]。基于此,本研究选用淡水发光菌青海弧菌Q67(Vibrio qinghaiensissp.Q67)为指示生物,检测疫情暴发前后长江流域污染物的生态毒性变化,为评价疫情暴发对长江流域水环境及生物的影响提供基础数据。
1 材料与方法(Materials and methods)
1.1 主要材料
以淡水发光菌青海弧菌Q67为指示生物,采用实验室制作的发光细菌冻干粉,初始发光强度高于200万光子数。Q67发光细菌具有独特的生理特性,在淡水体系中能正常发光,不需要添加大量的氯化钠,可直接应用于淡水环境样品的生物毒性测试[12,14]。国内许多研究者应用该菌种建立了新型发光菌毒性测定方法,已成功用于环境污染监测[12-17]。
1.2 样品采集
沿长江干流,分别在2019年12月(枯水期)、2020年6月(丰水期)和2020年10月(平水期),选取攀枝花江段(P1～P5共5个采样点)、三峡地区江段(SX1～SX5共5个采样点)、九江(鄱阳湖)江段(B1～B5共5个采样点)、南京江段(N1～N10共10个采样点),以及玉树采样点(作为背景对照)采集表层水样(表1)。水样经采水器采集后,保存在事先用铬酸洗过并用样品润洗过的棕色玻璃瓶中。采集后水样在运送至实验室期间密封在冰盒中,在实验室储存在-20 ℃条件下直至分析。每次取样前,用原位河水多次冲洗取样器,以避免可能的交叉污染。
表1 长江流域采样点位置(攀枝花江段、三峡江段、九江江段和南京江段)
Table 1 Location of sampling sites along the Yangtze River Basin(Panzhihua section, Sanxia section, Jiujiang section, and Nanjing section)
采样点Sampling site经度Longitude纬度Latitude江段Section省份ProvinceP1101.689626.5534攀枝花江段 Panzhihua section四川省 SichuanP2101.727226.59011攀枝花江段 Panzhihua section四川省 SichuanP3101.749526.59008攀枝花江段 Panzhihua section四川省 SichuanP4101.773226.5989攀枝花江段 Panzhihua section四川省 SichuanP5101.803326.6061攀枝花江段 Panzhihua section四川省 SichuanSX1111.27430.75687三峡江段 Sanxia section重庆市 ChongqingSX2110.288631.01516三峡江段 Sanxia section重庆市 ChongqingSX3109.527931.03693三峡江段 Sanxia section湖北省 HubeiSX4108.389530.8168三峡江段 Sanxia section湖北省 HubeiSX5107.741129.90096三峡江段 Sanxia section湖北省 HubeiB1116.215429.74715九江江段 Jiujiang secction江西省 JiangxiB2116.381529.84948九江江段 Jiujiang secction江西省 JiangxiB3116.625129.97642九江江段 Jiujiang secction江西省 JiangxiB4116.781930.09303九江江段 Jiujiang secction江西省 JiangxiB5116.916930.31684九江江段 Jiujiang secction江西省 JiangxiN1118.482231.78019南京江段 Nanjing section江苏省 JiangsuN2118.637931.96858南京江段 Nanjing section江苏省 JiangsuN3118.687232.03836南京江段 Nanjing section江苏省 JiangsuN4118.752832.12351南京江段 Nanjing section江苏省 JiangsuN5118.792132.14213南京江段 Nanjing section江苏省 JiangsuN6118.762732.19338南京江段 Nanjing section江苏省 JiangsuN7118.80632.23183南京江段 Nanjing section江苏省 JiangsuN8118.871432.17621南京江段 Nanjing section江苏省 JiangsuN9119.062332.22771南京江段 Nanjing section江苏省 JiangsuN10119.246832.21415南京江段 Nanjing section江苏省 Jiangsu
1.3 样品前处理与分析测试
部分水样用作原水急性毒性测试,剩余水样经玻璃纤维素膜(APFF,Millipore,美国)过滤后再用HLB柱(500 mg,OASIS,美国)富集,然后以正己烷、丙酮、二氯甲烷和甲醇各5 mL等溶剂梯度洗脱。洗脱液经旋蒸浓缩,添加无水硫酸钠脱水,采用二甲亚砜(DMSO)(99.5% GC,Sigma)置换溶剂,定容至0.2mL,-20 ℃下保存用于生物测试。
按照7个稀释倍数(1倍、4.7倍、9.4倍、18.8倍、37.5倍、75倍和150倍),用去离子水稀释待测水样。将发光细菌冻干粉复苏后进行试验,采用96微孔板高通量发光检测技术,通过Glomax Multi微孔板型多功能检测仪(Promega公司)进行发光检测。向每孔中加入100 μL去离子水(作为空白对照)或待测水样,再加入同体积的菌液,反应15 min后测定,每个浓度进行3次平行试验。采用Cary100紫外分光光度计(Agilent公司)、TS100-F倒置显微镜(Nikon公司)和240FS AA火焰原子吸收光谱仪(Agilent公司)检测样品相对发光率与细菌密度。实验结果分别以废水相对发光率和15 min半数效应浓度(EC50)表示,测定各点原水样和水样有机提取物对发光菌急性毒性[18]。
1.4 统计分析
采用SPSS Statistics(Version 23, IBM)进行数据统计分析,其中P<0.05被认为具有统计学意义。使用Origin Pro(Version 9.1, Origin Lab)和Excel(Version 2019, Microsoft Office)绘制图形。
2 结果与讨论(Results and discussion)
2.1 长江原水样的Q67发光细菌急性毒性效应
本研究将原水稀释7个倍数,利用淡水发光菌青海弧菌Q67测定浓缩后原水样的发光度,并以对照值(玉树样点)作比较得出相对发光率,以表征原水的急性毒性。在枯水期、丰水期和平水期,各采样区域原水样的急性毒性剂量效应关系曲线分别如图1～图3所示。总的来说,在3个采样季节,各采样点原水的相对发光率均随着原水稀释倍数的增加而降低,显示本研究所采用的发光细菌急性毒性测试结果具有较高的可信度。
图1 枯水期各采样区域的急性毒性剂量效应关系曲线
Fig. 1 Acute toxicity dose-response curve of each sampling section during dry season
图2 丰水期各采样区域的急性毒性剂量效应关系曲线
Fig. 2 Acute toxicity dose-response curve of each sampling section during wet season
图3 平水期各采样区域的急性毒性剂量效应关系曲线
Fig. 3 Acute toxicity dose-response curve of each sampling section during normal season
总的来说,对原水水样的检测结果表明,在本研究采集样品的3个季节,所有样点的水样均未检出急性毒性效应(图4)。空间分布上,长江水体的急性毒性(即相对发光率)总体上呈现出上游高于下游的趋势,即攀枝花江段(87.1±8.4)%>三峡江段(69.1±11.1)%>九江江段(54.0±9.4)%>南京江段(53.3±14.0)%,无显著差异(paired ttest, P>0.05)。季节分布上,长江水体的急性毒性(即相对发光率)总体上呈现出枯水期(68.2±15.7)%>平水期(62.4±18.2)%>丰水期(62.1±18.3)%的趋势,无显著差异(paired ttest, P>0.05)。值得注意的是,2019年12月底COVID-19疫情暴发,在经历了防控治疗后,当时疫情最严重的城市武汉在2020年4月解封。也就是说,本研究中的枯水期可以代表疫情暴发前,丰水期可以代表疫情暴发后,而平水期可以代表疫情常态化时期。因此,长江流域4个采样区域原水的急性毒性,并没有显示出受到疫情暴发的显著影响,而可能更多受到季节径流量的影响。例如,相较于枯水期,在丰水期增大的径流量可能会稀释表层水中的污染物浓度,进而降低水体的急性毒性。
图4 原水中Q67发光菌的相对发光率的时空分布
Fig. 4 The spatiotemporal distribution of the relative luminous efficiency of Q67 luminescent bacteria in raw water
2.2 长江水样有机提取物的Q67发光菌急性毒性效应
对不同季节各区域水样有机提取物浓缩样品进行检测,结果表明,对照样品玉树采样点和其他采样点检出了不同程度的急性毒性效应。将各采样点(除N2、N4外)的急性毒性数据转化成急性毒性的典型代表化合物氯化汞的毒性当量(图5),结果显示,在3个季节,长江流域表层水中有机污染物急性毒性呈现上游到下游逐渐升高的趋势,长江下游的南京江段表层水样有机提取物的急性毒性效应相对较高,其次是九江江段。此外,丰水期水样有机提取物的急性毒性显著高于(paired ttest, P<0.05)枯水期的,而平水期水样有机提取物的急性毒性略低于丰水期。丰水期处于疫情暴发时期,而平水期在疫情暴发后,可能会受到丰水期大量排放消毒剂与抗疫药物的影响,它们在水环境中半衰期为几天到几个月[17]。例如,在疫情期间,武汉市使用了约2 000 t消毒剂(例如次氯酸和过氧乙酸)来灭活病毒[19]。这些药物和消毒剂经过污水处理厂和地表径流,排放到周围的溪流、河流和湖泊中,并最终汇入长江,威胁水生态安全[20]。这也对应了本研究中,水样有机提取物浓缩样品对发光细菌的急性毒性在平水期略低于丰水期,即显示出受到了疫情暴发的影响。
图5 枯水期(a)、丰水期(b)和平水期(c)各采样区域水样的氯化汞毒性当量浓度
Fig. 5 Toxic equivalent concentration of mercury chloride in water from different sampling sections during dry season(a), wet season(b), and normal season(c)
随着COVID-19在全球蔓延,大量使用的消毒剂和抗疫药物会进入污水系统并污染饮用水资源,进一步导致全球水生生态系统的次生灾害[9,17]。位于长江流域中游的武汉是2020年疫情暴发的中心,经历了几个月的封城后,针对武汉封城后废水和地表水中的消毒副产物和COVID-19相关药物的浓度分布研究显示,消毒副产物的浓度随时间变化很小,表明疫情期间加强消毒对水环境中消毒副产物污染的影响有限,但抗疫药物,如洛匹那韦和利托那韦的浓度在疫情暴发期间显著增加,而且具有潜在的持久性[17]。疫情期间消毒剂和抗疫药物的大量排放,可能造成了长江流域水样的急性毒性效应。
2.3 长江水样有机提取物的氯化汞当量
因为氯化汞有地表水质标准,且Q67发光菌对其急性毒性敏感性较高,剂量效应关系曲线范围较宽,较适合作为Q67的标准对应物质[21]。因此,本研究进一步采用氯化汞标准毒性当量来定量研究长江流域表层水样的急性毒性变化。与相对发光率类似,用氯化汞标准毒性当量表示的三峡江段水样有机物的急性毒性均呈现出丰水期>平水期>枯水期的趋势,且南京江段水样有机物的急性毒性在丰水期与平水期浓度相近,均高于枯水期(表2)。以上现象显示,水体有机提取物的急性毒性在丰水期不降反增,即丰水期增大的径流量并没有稀释水体有机物的急性毒性浓度,表明在丰水期(疫情暴发期)与平水期(疫情常态化时期),均存在不同程度的污染输入,带来更高的急性毒性效应。因此,有必要在疫情常态化时期进行水生生态完整性评估,这可以保护生物多样性并保护人类健康[9]。
表2 长江流域4个江段不同季节水样有机物急性毒性检测结果
Table 2 Acute toxicity test results of organic concentrates in water from four sampling sections of Yangtze River Basin during different seasons (ng·L-1)
采样江段Sampling section枯水期 Dry season丰水期Wet season平水期Normal season范围 Range平均值 Mean范围Range平均值Mean范围Range平均值Mean攀枝花江段Panzhihua section298～380349252～363318230～367308三峡江段Sanxia section346～394376362～423397345～409383九江江段Jiujiang section380～404396437～655525346～393365南京江段Nanjing section327～785452357～830496362～867497
注:*Q67发光菌发光抑制检测,以氯化汞标准毒性当量表示。
Note: *luminescence inhibition assay for Q67 luminescent bacteria, and the toxicity data was expressed as standard toxicity equivalents of mercuric chloride.
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