菲(phenanthrene, PHE)属于多环芳烃类化合物(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)中典型化合物，是煤焦油中含量较高的组分，约占煤焦油的5%[1]。据报道，PHE会影响鱼类生长，改变机体的激素合成与代谢，诱导或阻断某些生理反应，影响繁殖和一些内分泌过程[2]。目前在我国许多水域都检测出PHE，已经严重污染水体环境，威胁水生生物的生存[3]。近年来，采用Person相关性指标评价延河水质各因子的污染指数中，石油类污染指数已有所缓解，但水质仍处于轻度污染状态，石油类污染因子仍需严格监控[4-5]。
研究表明，PHE对河蚬(Corbicula fluminea)、中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis H. Milne-Edwards)、双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis)、红鳍笛鲷(Lutjanus erythropterus)和斑马鱼(Danio rerio)等水生生物均有潜在毒性[6-9]。急性毒性静水实验表明，PHE对中华绒螯蟹、河蚬等淡水重要经济水产动物具有高毒性[6-7]。一定剂量的PHE会导致红鳍笛鲷肝脏中超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量及乙酰胆碱酯酶活性发生显著变化，通过氧化损伤对机体进行毒害作用[8]。但这些研究涉及分子水平的并不多。泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)属于鳅科(Cobitidae)泥鳅属(Misgurnus)，是生活在水底淤泥内的一类淡水硬骨鱼，其适应范围广泛、钻泥性强，具有较高的经济价值和环境价值，在实验室条件下易于驯养[10-11]。卵黄蛋白原(vitellogenin, VTG)作为雌激素效应的敏感生物标志物，是在内源性雌激素或外源性雌激素作用下，作用于卵生动物肝细胞的雌激素受体后在肝细胞中合成，经血液运输至性腺，为卵子的发生及幼体的孵化和发育提供营养和功能性物质[12-13]。硬骨鱼VTG可分为VTGAa、VTGAb和VTGC这3个分支，其中VTGA普遍存在于硬骨鱼中，属vtg1基因编码产物，VTGC存在于大多数鱼类中[14-15]。本研究以泥鳅为实验材料，检测分析PHE胁迫下性腺指数(gonadosomatic index, GSI)、肝脏指数(hepatosomatic index, HSI)和2种vtg(vtg1、vtgc)mRNA表达以及VTG水平的影响，探讨PHE对泥鳅的雌激素毒性效应，以期为多环芳烃类污染物PHE的环境评价提供科学依据。
1 材料与方法(Materials and methods)
1.1 实验动物
选取6月龄泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)为实验动物，平均体质量为(3.24±0.43) g，平均体长为(8.5±1.1) cm，购自陕西省水产动物养殖基地。在实验室条件下驯养2周。使用自然晾晒96 h的脱氯自来水(pH值7.5)，水温(24±2) ℃，正常光照，期间喂食少量面包碎屑并及时更换水。在驯养期间密切观察泥鳅健康情况，及时去除体色异常、受伤受损及死亡的泥鳅。取样的前3 d停止投食，挑取体格强健活跃的泥鳅进行实验。
1.2 染毒实验
根据预实验，在安全浓度之下设置4个PHE(纯度>95%，源叶生物)浓度处理组：1.33、1.77、2.36和3.13 mg·L-1，同时设置对照组，每组设3个平行处理组，进行28 d染毒实验。每桶配制3 L PHE溶液，每桶放入20尾泥鳅(雌雄比4∶6)。暴露期间每天更换全部药液以保持PHE浓度的稳定。
1.3 性腺指数、肝脏指数的测定
在28 d染毒周期内，分别于7、14和28 d进行取样，并称量所取出的泥鳅肝脏、性腺质量，计算GSI、HSI。并取肝脏、精巢和卵巢组织约50～100 mg，液氮保存待提取RNA。
1.4 vtg1、vtgc mRNA表达的检测
采用PCR和qRT-PCR方法分别进行定性、定量检测。使用Torizol试剂盒提取总RNA，并检测所提取样品总RNA纯度(A260/A280：1.8～2.2)与浓度，将其稀释到200～500 ng·μL-1左右，取1 μL进行去gDNA和反转录(反转录试剂盒，宝生物工程有限公司)。使用Primer 6软件设计引物序列(表1)，合成操作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。按照试剂盒说明书完成qRT-PCR实验，根据公式：倍数变化=2-ΔΔCt=2-[(Ct处理组目的基因-Ct处理组内参基因)-(Ct对照组目的基因-Ct对照组内参基因)]计算。
1.5 VTG含量的测定
取肝脏、性腺，以1∶19的体积比加入PBS缓冲液，在4 ℃ 3 000 r·min-1离心15 min后，采用鱼类卵黄蛋白原(VTG)ELISA检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，中国)测定泥鳅肝脏、性腺中VTG含量，每个平行处理组测定3次，试剂盒检测范围30～480 ng·mL-1。
1.6 数据处理
采用 SPSS20.0、Origin统计软件进行显著性分析与制图，数据均用平均值±标准差(Mean±SD)表示，采用T检验验证该组数据是否符合正态分布，各组间的差异采用单变量方差分析及Duncun多重比较，P<0.05、P<0.01为差异显著。
2 结果(Results)
2.1 菲胁迫下泥鳅肝脏指数、性腺指数的变化
图1(a)中，随着PHE浓度的升高，雄性泥鳅HSI呈上升趋势，且胁迫时间越长，上升趋势越显著。在2.36 mg·L-1、3.13 mg·L-1组，HSI显著升高(P<0.05)。在相同浓度、不同暴露时间之间，雄性泥鳅HSI无显著变化。
图1(b)中，随着PHE浓度的升高，雌性泥鳅HSI呈上升趋势。在暴露14 d，雌性泥鳅HSI随暴露剂量的升高而上升，但与对照组相比无显著差异；而7 d、28 d，在3.13 mg·L-1组雌性泥鳅HSI显著升高(P<0.05)。
图2(a)中，随着PHE浓度的升高，雄性泥鳅GSI呈显著下降趋势。同一PHE浓度组，随着暴露时间的延长雄性泥鳅GSI呈下降趋势。在1.33 mg·L-1组PHE胁迫下，GSI在7、14和28 d均发生显著变化(P<0.05)。与对照组相比，其他3个PHE暴露组，雄性泥鳅GSI也呈显著性差异(P<0.05)。
图2(b)中，各处理组与溶剂对照组相比，雌性泥鳅GSI明显上升。在1.33 mg·L-1组，雌性泥鳅GSI没有发生显著变化。在1.77 mg·L-1组，雌性泥鳅暴露28 d时GSI显著上升(P<0.05)，在3.13 mg·L-1组GSI达到最大值。
表1 目的基因和内参基因引物序列
Table 1 Target gene and internal reference gene primer sequences
引物名称Primer name序列(5’～3’)Sequence (5’～3’)vtg1-F ATGAGAAAGTCGCCGCAATCvtg1-R GCCCATGACTTTCAAAGCCAvtgc-F CTGGATATGGCTGTTGGTGCvtgc-R ACTTGCAAGCAGTCGGAAAGβ-actin-F AGAGAGAAATTGTCCGTGACβ-actin-RGCCAATGGTGATGACCTGT
图1 菲对泥鳅肝脏指数的影响
注：相同字母表示在相同时间下、不同浓度之间无显著差异，反之则存在显著差异；下同。
Fig. 1 Effect of phenanthrene on hepatosomatic index of Misgurnus anguillicaudatus
Note: The same letter means that at the same time, there is no significant difference between different concentrations, otherwise there is a significant difference; the same below.
2.2 菲胁迫下泥鳅卵黄蛋白原基因表达的变化
2.2.1 样品总RNA质量检测及PCR扩增验证
取肝脏、精巢和卵巢样品，用NanoDrop2000测得各样品中总RNA A260/A280和A260/A230比值都在1.9～2.1之间，表明提取的总RNA污染较少，纯度高，可以进行后续实验。选取各处理组反转录样品进行PCR，目标条带清晰，可以进行后续实验(图3)。
图2 菲对泥鳅性腺指数的影响
Fig. 2 Effect of phenanthrene on gonadosomatic index of Misgurnus anguillicaudatus
图3 各组织样品普通PCR凝胶电泳图谱
注：凝胶电泳条带上(a)～(d)分别代表卵巢、精巢、雌性肝脏、雄性肝脏。
Fig. 3 General PCR gel electrophoresis pattern of each tissue sample
Note: The gel electrophoresis bands (a)～(d) represent ovary, testis, female liver and male liver respectively.
2.2.2 菲胁迫下泥鳅vtg mRNA表达量的变化
2.2.2.1 雄性泥鳅肝脏vtg表达量的变化
由图4可知，雄性泥鳅肝脏vtg1和vtgc mRNA水平整体呈现升高的趋势。暴露7 d，vtg1和vtgc mRNA水平随PHE浓度上升呈上升趋势，分别在3.13 mg·L-1组和1.77 mg·L-1组出现显著升高(P<0.05)。暴露14 d，雄性泥鳅肝脏vtg1表达量随PHE浓度升高呈先上升后下降的趋势，vtgc表达量随PHE浓度升高而上升。暴露28 d，雄性泥鳅肝脏vtg1和vtgc表达量与剂量呈倒U型曲线关系。此外，比较相同浓度不同时间vtg1和vtgc表达量变化，在1.33 mg·L-1、1.77 mg·L-1组暴露14 d、28 d时vtgc表达水平较7 d组显著升高(P<0.05)；而3.13 mg·L-1组暴露14 d、28d时vtg1和vtgc最高表达量达3.41倍和6.71倍，且与7 d组相比显著上升(P<0.01)。
图4 菲对雄性泥鳅肝脏vtg1和vtgc表达量影响
注：相同字母表示相同时间内、不同浓度之间差异显著，反之则存在显著差异；*P<0.05、**P<0.01，在同浓度下、不同暴露时间之间有显著差异；下同。
Fig. 4 Effects of phenanthrene on vtg expression in the liver of male Misgurnus anguillicaudatus
Note: The same letter indicating no difference between different concentrations within the same time, and vice versa；*P<0.05, **P<0.01 indicate that there is significant difference between different exposure times at the same concentration; the same below.
2.2.2.2 雌性泥鳅肝脏vtg表达量的变化
由图5可知，雌性泥鳅肝脏vtg1和vtgc mRNA水平随PHE胁迫浓度升高呈现上升趋势。暴露7 d，2.36 mg·L-1、3.13 mg·L-1组vtg1和vtgc表达量发生显著变化(P<0.05)，在3.13 mg·L-1组vtg1和vtgc表达量达到最高值，分别为1.88倍和1.90倍。暴露14 d，3.13 mg·L-1组vtg1表达量显著上升(P<0.05)，各浓度组vtgc表达量发生显著变化(P<0.05)。暴露28 d，vtg1表达量除1.33 mg·L-1组外，其他3个浓度组都存在显著差异，各浓度组vtgc表达量显著上升(P<0.05)。此外，比较相同浓度下不同时间雌性泥鳅肝脏vtg1和vtgc表达量发现，在PHE暴露14 d、28 d，雌性泥鳅肝脏vtg表达量有显著升高。
图5 菲对雌性泥鳅肝脏vtg1和vtgc表达量影响
Fig. 5 Effects of phenanthrene on vtg expression in the liver of female Misgurnus anguillicaudatus
2.2.2.3 泥鳅精巢vtg表达量的变化
图6中，泥鳅精巢在PHE暴露下vtg表达量随着暴露浓度升高、暴露时间的延长整体呈上升趋势。在1.77、2.36和3.13 mg·L-1组，泥鳅精巢vtg表达量显著升高。从时间尺度来看，vtgc表达量在7 d、28 d随着PHE浓度的升高而显著上升(P<0.05)，vtg1在7、14和28 d暴露期表达量与暴露浓度呈倒U型曲线，vtgc表达量变化在暴露14 d亦出现类似情形。在3.13 mg·L-1组，随着暴露时间的延长，vtg1、vtgc表达量呈现上升的趋势，vtg1在28 d时达到最高值为3.21倍，vtgc表达量变化在暴露28 d达到最高3.39倍。随着时间的延长，2.36 mg·L-1组诱导vtg1、vtgc表达量上调趋势较为显著。
图6 菲对泥鳅精巢vtg1和vtgc表达量影响
Fig. 6 Effects of phenanthrene on vtg expression in testis of Misgurnus anguillicaudatus
2.2.2.4 泥鳅卵巢vtg表达量的变化
图7中，泥鳅卵巢vtg表达量随着PHE暴露浓度升高、暴露时间的延长呈上升趋势。暴露7 d，2.36 mg·L-1、3.13 mg·L-1组PHE暴露下卵巢vtg1和vtgc表达量呈显著升高(P<0.05)；在暴露28 d，1.77 mg·L-1组vtg1和vtgc表达量开始出现显著差异(P<0.05)。随着PHE暴露浓度的升高泥鳅卵巢vtg表达量不断上升，在3.13 mg·L-1组达到最高值。此外，3.13 mg·L-1组vtgc表达量随着时间的延长不断升高且存在显著差异(P<0.01)。
图7 菲对泥鳅卵巢vtg1和vtgc表达量影响
Fig. 7 Effects of phenanthrene on vtg expression in ovary of Misgurnus anguillicaudatus
2.3 菲胁迫下泥鳅VTG含量的变化
图8(a)中，与对照组相比，雄性泥鳅肝脏VTG含量随着PHE浓度的升高，整体呈现先上升、后下降的趋势。暴露7 d，雄性泥鳅肝脏VTG含量随PHE浓度升高呈现先下降后上升再下降的趋势，在1.33 mg·L-1发生显著降低(P<0.05)，2.36 mg·L-1处理组VTG值最高。暴露14 d，1.77 mg·L-1、2.36 mg·L-1组VTG含量显著上升且在1.77 mg·L-1组达到最高。暴露28 d，1.33 mg·L-1组VTG值最高。此外，在1.33 mg·L-1、2.36 mg·L-1组，随着胁迫时间的延长，雄性泥鳅肝脏VTG含量呈现上升趋势。在1.77 mg·L-1组，随着胁迫时间的延长，雄性泥鳅肝脏VTG含量整体呈现先上升后下降的趋势，在3.13 mg·L-1组亦是这样的趋势。
图8(b)中，与对照组相比，雌性泥鳅肝脏中VTG含量随着PHE胁迫浓度的升高，整体呈现先上升、后下降的趋势。暴露7 d，雌性泥鳅肝脏VTG含量随PHE浓度升高呈先下降后上升再下降的趋势，且各浓度组之间无显著差异。暴露14 d、28 d，2.36 mg·L-1、3.13 mg·L-1组VTG含量存在显著差异(P<0.05)，并在整个暴露期内随暴露浓度升高呈先上升后下降的趋势。同时，在1.33 mg·L-1组，随着胁迫时间的延长，雌性泥鳅肝脏VTG含量呈现上升趋势，在2.36 mg·L-1、3.13 mg·L-1组亦是这样。
图8 菲对泥鳅肝脏VTG含量的影响
Fig. 8 Effects of phenanthrene on liver VTG content in Misgurnus anguillicaudatus
在1.77 mg·L-1组，随着胁迫时间的延长，雌性泥鳅肝脏VTG含量呈现先下降后上升的趋势，在28 d时出现显著性差异(P<0.05)且达到最高值。
图9(a)中，泥鳅精巢VTG含量随PHE浓度的升高以及暴露时间的延长而上升。暴露7 d、14 d，1.33 mg·L-1组PHE暴露下引起精巢VTG含量上升，1.77 mg·L-1组VTG含量开始出现显著升高(P<0.05)。暴露28 d，泥鳅精巢VTG含量随PHE浓度的升高而显著上升(P<0.05)。
图9(b)中，泥鳅卵巢VTG含量随着PHE胁迫浓度的升高而上升。暴露7 d，在2.36 mg·L-1组泥鳅卵巢VTG含量出现显著上升(P<0.05)。暴露14 d，除1.33 mg·L-1组外，其他浓度组VTG含量上升趋势显著(P<0.05)。暴露28 d，VTG含量随PHE浓度升高显著上升，且与对照组有显著差异(P<0.05)。
图9 菲对泥鳅性腺VTG含量的影响
Fig. 9 Effects of phenanthrene on gonad VTG content in Misgurnus anguillicaudatus
3 讨论(Discussion)
3.1 菲胁迫对泥鳅HSI、GSI的影响
HSI和GSI分别代表肝脏指数和性腺指数，反映动物肝脏和性腺器官发育情况、成熟程度[16]。有研究表明，高浓度的环境污染物会直接作用于鱼类的代谢作用进而影响鱼类生长的整体发育，导致HSI升高，HSI大小与污染物暴露剂量成正比[17]。本实验中，PHE暴露导致雄性泥鳅HSI上升，2.36 mg·L-1、3.13 mg·L-1组对HSI影响较为显著，这表明PHE胁迫会导致泥鳅肝脏发育异常。雌性泥鳅HSI随PHE胁迫浓度的升高呈现升高趋势，在3.13 mg·L-1组显著高于对照组，雌性泥鳅HSI响应PHE胁迫较为缓慢，这可能是由于雌性泥鳅肝脏对PHE胁迫代谢能力较雄性高，在较低浓度下没有明显的变化，但随着PHE胁迫浓度的升高，有毒物质不断累积，导致雌性泥鳅肝脏损伤。
同时，研究表明，环境雌激素类物质会引起鱼类性腺组织损伤。赵荧等[18]发现日本青鳉雄鱼暴露在酞酸酯中会显著降低其GSI，宫向红等[19]用不同浓度辛基酚胁迫鲤，结果表明，雄性GSI随胁迫浓度升高而减小，雌性GSI随胁迫浓度升高而增加。本研究中，PHE胁迫对泥鳅GSI有显著影响，随着暴露浓度的升高和暴露时间的延长，雄性泥鳅GSI呈下降趋势，在3.13 mg·L-1组胁迫28 d达到最低。雌性泥鳅在PHE暴露下GSI显著升高，提示PHE可能具有一定的类雌激素效应，作用于雄性泥鳅时，干扰体内正常雄激素水平，导致精巢发育受阻，而作用于雌性则促使雌激素水平过高，导致卵巢发育异常。
3.2 菲胁迫对泥鳅VTG的影响
VTG通常是由雌性个体产生的，而当雄性个体中出现时，则表明生物体受到了雌激素内分泌干扰物的污染[20]。黄晔等[21]发现，雄性斑马鱼在壬基酚和双酚A胁迫下，引发肝脏vtg mRNA表达量明显上升，且具有明显的时间-剂量效应。付娟娟等[22]将稀有鮈鲫暴露在苯并芘和邻苯二甲酸二酯下，发现稀有鮈鲫性腺和肝脏中vtg表达量显著上调，表现出生殖内分泌干扰效应。本研究结果表明，PHE暴露引起泥鳅肝脏和性腺中vtg1和vtgc mRNA表达量水平上升，并随着PHE暴露剂量的升高，vtg表达量呈现不同程度的升高，这说明PHE对泥鳅肝脏和性腺有明显的内分泌干扰作用，表现出类雌激素效应，而不同浓度、不同暴露时间对vtg表达影响存在差异，可能是由于PHE刺激机体肝脏解毒代谢，影响下丘脑-垂体-性腺轴的反馈调节机制，导致vtg表达量随浓度和时间而变化。不同的是，Sun等[23]将海洋青鳉(Oryzias melastigma)暴露在60 μg·L-1 PHE 80 d后检测到肝脏vtg1、vtg2表达量显著下调，这可能是因为暴露时间较长从而抑制基因表达，也可能是泥鳅属淡水鱼有别于海洋青鳉。同时，vtg表达量变化在泥鳅肝脏、性腺中存在一定差异，肝脏中vtg表达量变化幅度较性腺大。类似的结果在其他文献中也有描述，陈亚文等[24]通过检测双酚AF胁迫下斑马鱼卵黄蛋白原基因表达发现，0.5 mg·L-1 BPAF暴露下雄性斑马鱼肝脏vtg表达量显著升高，而性腺中vtg表达量升高但无显著差异。出现这种差异的原因可能是由于泥鳅不同组织对PHE吸收、代谢和分布不同，导致肝脏和性腺vtg表达量变化存在差异。
本研究还检测到，泥鳅vtg对PHE胁迫响应有一定的性别差异。在泥鳅肝脏vtg mRNA水平变化中，雄性vtg1和vtgc表达量相对于雌性增幅较大，且在雄性肝脏、精巢中，vtg表达量出现了明显的低浓度诱导、高浓度抑制的效应关系，呈现典型毒性物质刺激Hormesis效应，判断可能是类雌激素效应。精巢vtg1和vtgc表达水平上升幅度较卵巢大，主要体现在1.33 mg·L-1组精巢vtg1和vtgc表达量就存在显著升高，而卵巢vtg表达量显著上调普遍发生在2.36 mg·L-1组。在陈述[25]有关17α-乙炔基雌二醇(EE2)调控稀有鮈鲫vtg基因表达中，也得到了相似的结果，即EE2使得稀有鮈鲫雄鱼vtg表达量变化远大于雌鱼。上述结果提示，一定浓度PHE胁迫对雌、雄性泥鳅vtg1和vtgc表达均具有诱导作用，对雄性泥鳅尤为显著。
此外，不同vtg mRNA水平响应PHE胁迫程度也不同，暴露7 d，雄性泥鳅肝脏vtg1和vtgc mRNA水平与暴露剂量成正相关，vtg1表达在3.13 mg·L-1组与对照组呈显著差异，vtgc差异表达出现在1.77 mg·L-1组，而泥鳅精巢中则分别在1.77 mg·L-1、2.36 mg·L-1组出现显著性差异，这说明在雄性泥鳅肝脏、性腺中，2个基因在响应PHE胁迫的敏感浓度区不同。PHE在引起泥鳅内分泌干扰效应中，vtgc表达量变化较vtg1明显，在雄性中更为明显。提示PHE可以通过诱导泥鳅vtgc和vtg1表达发挥其雌激素效应，其中对vtgc的诱导作用更大。
VTG作为卵生脊椎动物卵黄的前体蛋白，通过ELISA酶联免疫分析直接测定VTG含量也是反映环境干扰物雌激素效应的重要方法。杨倩等[26]采用ELASA法测定双酚A替代物胁迫下斑马鱼体内VTG含量，结果显示，双酚A及其常见替代物会引起斑马鱼体内VTG含量升高，且具有一定的剂量-效应关系。程艳等[27]在研究全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate, PFOS)对斑马鱼的雌激素效应中也得到了类似的结果，并发现了斑马鱼对PFOS响应存在性别差异，雄鱼在PFOS暴露下呈现显著的低浓度诱导、高浓度饱和抑制的毒物刺激Hormesis效应。本研究结果，泥鳅肝脏VTG含量随着PHE胁迫剂量的升高和时间的延长，呈现先上升后下降的趋势，而性腺VTG含量随着PHE胁迫浓度的上升而增加，且性腺中VTG含量略低于肝脏，这可能是由于VTG的合成本就是依赖于内源性或外源性雌激素对肝细胞的刺激，性腺中的VTG是由肝脏合成的VTG通过血液循环运输而来的，响应PHE胁迫会存在一定的时间滞后性。此外，PHE暴露下雄性泥鳅肝脏的高浓度饱和抑制点大致出现在2.36 mg·L-1组，而雌性则出现在3.13 mg·L-1组，这说明PHE不仅可以诱导泥鳅肝脏VTG的合成，且诱导作用在雄性中表现的更为显著。
综上，PHE胁迫会导致泥鳅肝脏损伤、性腺发育异常，诱导泥鳅肝脏和性腺中vtg1和vtgc表达量上调，使得VTG含量升高，干扰性腺作用轴且这种影响在雄性泥鳅中尤为显著。
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