甲氧虫酰肼为第二代双酰肼类昆虫生长调节剂，由美国罗姆-哈斯（现科迪华）公司1990年发现，已被广泛应用于水稻、小麦、棉花、果树和蔬菜等农作物上鳞翅目害虫（如水稻螟虫、棉铃虫、甜菜夜蛾和甘蓝夜蛾等）的防治[1-2]。该药剂属于蜕皮激素激动剂，它引起昆虫幼虫停止取食，加快蜕皮进程，使害虫在成熟前因提早蜕皮而致死，主要通过胃毒作用致效，同时也具有一定的触杀及杀卵活性[3]。甲氧虫酰肼在使用初期被普遍认为对人畜毒性较低且对环境安全，在世界范围内被迅速推广。然而随着甲氧虫酰肼大量广泛使用，越来越多的研究证明其具有残效期长、且毒性较高、对地下水和水生生物具有极高的毒性风险，给该产品的推广使用带来了严重不利影响[4-5]。目前，已有不少国家正在加强对甲氧虫酰肼的监控，对其残留限量采取更严格的标准，且提出限制使用计划[6]。
家蚕（Bombyx mori）是我国特有的一种经济昆虫，在农业生态系统中占有重要地位，且在人们长期驯养过程中，由于人为提供适合其生长发育的环境条件，使其在经济性状得到充分表现的同时，抗逆性明显减弱，极易受到外界各种因素如温度、湿度以及农药等影响[7]。在当前及今后相当长的一段时期内，化学防治仍是害虫综合治理中不可缺少的重要防治手段[8]。在农业生态系统中，家蚕是对化学农药十分敏感的非靶标昆虫，且家蚕与许多农林害虫及多种桑树害虫同属鳞翅目昆虫，当蚕区大量使用农药防治桑树害虫或在桑园附近农田防治农作物害虫时，因桑叶受到污染而导致家蚕中毒的事故经常发生[9]。
尽管已有研究表明甲氧虫酰肼对家蚕具有极高的急性毒性效应，但慢性毒性研究更接近于客观现实情况，目前有关甲氧虫酰肼对家蚕的慢性毒性研究尚未见报道[10]。随着科学的发展，国内外不少学者认识到农药的毒性和风险性是2个既有联系又有区别的概念，风险性是毒性和暴露的函数[11]。一种农药的毒性即使非常高，但如果在田间的实际暴露量极低，也可能只是具有低风险性[12]。因此，评估农药的生态风险性，除了测定农药对非靶标生物的毒性效应以外，还应考虑其在田间的实际暴露情况。此外，考虑到不同农药厂家生产的甲氧虫酰肼制剂可能对家蚕具有不同的毒性效应，影响其生态风险评价结果，本研究采用甲氧虫酰肼原药评价其对家蚕的毒性效应，且结合田间推荐剂量进行初级风险评估，旨在为甲氧虫酰肼的安全合理使用奠定理论基础，同时也为我国蚕桑业的可持续发展提供科学依据。
1 材料与方法（Materials and methods）
1.1 试验材料
1.1.1 供试生物
试验用家蚕品系为皓月×菁松，由浙江省蚕种质量检验检疫站提供。用常规方法催青和饲养，以二龄起蚕为供试生物。试验温度为24～27 ℃，相对湿度为70%～85%。试验用桑叶采自浙江省农业科学院蚕桑研究所桑园基地。
1.1.2 试验药剂与主要试剂
供试药剂：97.6%甲氧虫酰肼原药（科迪华农业科技有限责任公司）。主要试剂：丙酮（分析纯，永华化学科技（江苏）有限公司）；吐温-80（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；去离子水（杭州洁露纯净水厂）。在室内将甲氧虫酰肼原药、10%吐温-80（m∶V）和丙酮（加足100%）加工成甲氧虫酰肼高浓度母液，然后用去离子水对母液稀释后对家蚕进行毒性测定。
1.1.3 主要仪器和设备
Potter喷雾塔（英国BURKARD公司）；通风式昆虫毒性试验培养装置（直径20 cm，高15 cm）；N86KT.18隔膜真空泵（德国KNF公司）；玻璃培养皿（直径为15 cm），AR224CN电子天平（感量0.0001 g，奥豪斯仪器（常州）有限公司）；MLR-351H植物培养箱（日本三洋电机株式会社）；DSR-THEXT-RA温湿度记录仪（佐格微系统有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 桑叶的处理
参照我国国家标准化学农药环境安全评价中家蚕慢性毒性试验准则（NY/T 3087—2017）[13]中推荐的定量喷雾法处理桑叶。采摘桑树顶端新鲜有光泽的桑叶，每片叶质量2.0～3.0 g。以初始喷雾体积2 mL、喷雾压力48.3 kPa（7 psi）、沉降时间20 s作为标准参数，用Pottar喷雾塔将不同浓度的药液喷于桑叶的背面，晾干后供蚕食用。喷药前后分别称取桑叶的质量，以测定每片桑叶上喷施的药剂的准确量。试验时在培养装置底部铺2～4 mm的琼脂层保湿。每个装置为一个重复，对照组和处理组均设3个重复，每个重复处理20头二龄起蚕。
1.2.2 急性毒性试验
按照1.2.1节的方法处理桑叶，进行急性毒性试验。通过预备试验确定家蚕全部致死和全部存活的浓度范围，正式试验在此浓度范围内以一定的等比级差设置处理浓度，同时设置空白对照组和溶剂对照组。以饲喂去离子水处理桑叶的二龄起蚕为空白对照；以饲喂最高浓度组中所含丙酮和吐温-80的量处理桑叶的二龄起蚕为溶剂对照。将处理后的桑叶背面朝上放置于直径为15 cm的培养皿内，每皿2片叶。选择健康、大小一致的二龄起蚕，随机放入桑叶上。整个试验期间饲喂染毒桑叶，96 h后改喂无毒新鲜桑叶，观察并记录添毒后蚕的中毒死亡情况。幼虫死亡的判断标准是用镊子轻触蚕体无反应或轻吹蚕体无反应。
因甲氧虫酰肼为昆虫生长调节剂，需要延长观察时间至各处理组24 h内平均死亡率增加<10%为止，即延长观察时间至168 h，故判定急性毒性等级以168 h为毒性终点。试验结束后，用DPS v18.1版数据处理软件进行分析和计算，计算死亡率、药剂对家蚕二龄幼虫在不同时间的半致死浓度值（LC50）及95%置信限。
1.2.3 慢性毒性试验
根据预试验结果，配制6.17×10-3、1.85×10-2、5.56×10-2、1.67×10-1和5.00×10-1 mg·L-1系列浓度的药液，按照1.2.1节的方法处理桑叶，进行慢性毒性试验。以药剂与桑叶的质量比计算其实际暴露药剂浓度分别为1.00×10-3、3.05×10-3、1.04×10-2、2.74×10-2和7.98×10-2 mg·kg-1（以单位桑叶质量计）。同时设置空白对照组和溶剂对照组。将处理后的桑叶叶柄插入灌满10%琼脂培养基的1.5 mL离心管中，背面朝上放置于通风式昆虫毒性试验培养装置内。待供试家蚕取食染毒桑叶48 h后，转移至干净培养装置中并饲喂无毒桑叶至熟蚕期。熟蚕上蔟结茧、化蛹。幼虫饲养期间观察并记录眠蚕体质量。上蔟后第8天采茧，称全茧量、茧层量，计算茧层率、结茧率、化蛹率和死笼率等生物学指标和经济性状指标。用SPSS 18.1统计分析软件对各个生物学指标和经济性状指标进行差异显著性分析。
1.3 风险评估
1.3.1 初级暴露分析计算方法
根据农药的使用方法和家蚕的暴露途径，选择飘移场景对其进行风险评估。根据我国农业行业标准《农药登记 环境风险评估指南 第5部分: 家蚕》（NY/T 2882.5—2016）[14]，按式（1）和式（2）分别计算多次施药后最外围桑树上的预测暴露浓度（PECma-fr）和次外围桑树上的预测暴露浓度（PEC ma-sr）。
PECma-fr=AR×RUD95×DFPHI×MAF×PDFfr
（1）
PECma-sr=AR×RUD95×DFPHI×MAF×PDFsr
（2）
式中：PECma-fr表示多次施药后最外围一行桑树上的预测暴露浓度（mg·kg-1）；PECma-sr表示多次施药后次外围一行桑树上的预测暴露浓度（mg·kg-1）；AR表示单位面积农药最高使用剂量（kg·hm-2）；RUD95表示类似桑树的作物第95百分位的单位残留量（mg·kg-1）/（kg·hm-2）；PDFfr表示最外围一行桑树上的漂移因子；PDFsr表示次外围一行桑树上的漂移因子。DFPHI表示桑叶上农药的降解系数，可根据公式DFPHI=e-ln2×PHI/DT50计算，式中DT50表示农药在桑叶上的降解半衰期（d），采用默认值10 d；PHI表示农药最后一次使用距离桑叶采收的间隔期（d），采用默认值1 d。MAF为多次施药因子，可根据MAF=（1-e-n×i×ln2/DT50）/（1-e-i×ln2/DT50）计算，式中n表示施药次数，i表示施药间隔期（d）。
1.3.2 效应分析
1.3.2.1 初级效应分析
采用急性试验得出的毒性终点（EnP）和相应的不确定性因子（UF），按照式（3）计算预测无效应浓度（PNEC）。
PNEC=EnP÷UF
（3）
式中：PNEC表示预测无效应浓度（mg·kg-1）；EnP表示试验得出的毒性终点（mg·kg-1）；UF表示相应的不确定性因子。
1.3.2.2 高级效应分析
采用慢性试验得出的毒性终点（NOEC）和对应的不确定性因子（UF），按照式（4）计算预测无效应浓度（PNEC）。
PNEC=NOEC÷UF
（4）
式中：PNEC表示预测无效应浓度（mg·kg-1）；NOEC表示慢性试验得出的毒性终点（mg·kg-1）；UF表示相应的不确定性因子。
1.3.3 风险表征
采用风险商值（RQ）进行风险表征，按照式（5）计算
RQ=PEC÷PNEC
（5）
式中：PEC表示预测暴露浓度（mg·kg-1）；PNEC表示预测无效应浓度（mg·kg-1）。当RQ≤1，风险可接受；当RQ>1，则风险不可接受。
2 结果与分析（Results and analysis）
本研究测试的甲氧虫酰肼对家蚕毒性评价中，溶剂对照组与空白对照组的所有毒性指标相比均没有显著差异，因此，所有指标的评价均以空白对照组为基准。
2.1 甲氧虫酰肼对家蚕的急性毒性效应
在测试的甲氧虫酰肼暴露浓度下，二龄起蚕在处理24～48 h后，家蚕无死亡现象；72 h调查时，家蚕开始出现死亡；96～168 h调查时，表现出较明显的致毒效应。试验过程中观察到家蚕幼虫表现出的中毒症状为：食桑少，存活个体比对照组小，高浓度处理组提前出现眠蚕和蜕皮特征，部分个体头壳开裂且不能蜕皮，体色渐黑，侧倒死亡且死亡过程较长。结果表明，甲氧虫酰肼对家蚕的急性毒性表现较为缓慢。根据甲氧虫酰肼在不同测试时期对家蚕LC50值，在120～168 h的暴露时期，随着暴露时间的延长，毒性均显著增强（表1）。
2.2 甲氧虫酰肼对家蚕的慢性毒性
2.2.1 对眠蚕及熟蚕体质量的影响
眠蚕体质量是家蚕幼虫生长发育较为敏感的指标之一，微量的杀虫剂就有可能造成眠蚕体质量的变化。与对照组相比，当药剂浓度≥1.04×10-2 mg·kg-1时，处理组二眠和三眠蚕体质量均有显著性差异，且均显著低于对照（P<0.05） （图1（a）和1（b））；对于四眠和熟蚕体质量，当药剂浓度≤1.04×10-2 mg·kg-1时，处理组四眠和熟蚕体质量与对照组相比差异不显著；当药剂浓度≥2.74×10-2 mg·kg-1时，处理组四眠和熟蚕体质量均显著低于对照组（P<0.05） （图1（c）和1（d））。此外，本研究结果还表明随着甲氧虫酰肼浓度的增加，各龄眠蚕及熟蚕体质量呈现明显下降的趋势。
2.2.2 对家蚕幼虫生长发育、结茧率和化蛹率的影响
当药剂浓度≥2.74×10-2 mg·kg-1时，处理组家蚕幼虫的死亡率显著高于对照组（P<0.05），结茧率和化蛹率均显著低于对照组（P<0.05），且药剂处理浓度
表1 甲氧虫酰肼对二龄家蚕的急性毒性
Table 1 Acute toxicity of methoxyfenozide to 2nd instar larvae of silkworm
时间/hTime/h毒力回归方程Toxicity regression equationLC50/（mg·kg-1）（以单位质量桑叶计）LC50/（mg·kg-1） （Based on mulberry leaves）95%置信区间/（mg·kg-1）（以单位质量桑叶计）95% confidence interval/（mg·kg-1） （Based on mulberry leaves）R296Y=5.267+1.831X0.7150.509～1.170.943120Y=5.923+2.297X0.3960.319～0.5270.950144Y=6.803+2.863X0.2350.202～0.2810.958168Y=7.635+3.024X0.1340.117～0.1540.966
越高，对家蚕的生长发育和结茧率影响越大。当药剂浓度≤1.04×10-2 mg·kg-1时，处理组对家蚕幼虫的死亡率、结茧率和化蛹率与对照组相比均无显著性差异（P<0.05） （表2）。
2.2.3 对家蚕主要经济性状指标的影响
当药剂浓度≥2.74×10-2 mg·kg-1时，处理组全茧量和蛹质量均显著低于对照组（P<0.05） （图2（a）和2（d））；当药剂浓度≤1.04×10-2 mg·kg-1时，处理组全茧量和蛹质量与对照组相比无显著性差异（图2（a）和2（d））；当药剂浓度≥1.04×10-2 mg·kg-1时，处理组茧层量和茧层率均显著低于对照组（P<0.05），其余处理组与对照组相比均无显著差异（图2（b）和2（c））。
图1 甲氧虫酰肼对家蚕眠蚕体质量的影响
注：图中数据经Duncan新复极差法检验，同组数据后不同字母表示在0.05水平具有显著差异；图中的药剂浓度是以药剂与桑叶的质量比计算得其实际的暴露浓度；下同。
Fig. 1 Effect of methoxyfenozide on the body weight of moulting silkworm
Note: The data in the figures are tested by Duncan’s new multiple range method; different letters after the same group of data indicate that there are significant differences at the level of 0.05; the pesticide concentration in the figures is the actual exposure concentration calculated according to the mass ratio of pesticide to mulberry leaf; the following figure is the same.
表2 甲氧虫酰肼对家蚕生长发育、结茧率及化蛹率的影响
Table 2 Efffect of methoxyfenozide on the growth, percentage of cocooning and pupation of silkworm
药剂浓度/（mg·kg-1）（以单位质量桑叶计）Pesticide concentration/（mg·kg-1） （Based on mulberry leaves）供试蚕数/头Number of silkworm幼虫死亡率/%Mortality rate of silkworm larvae/%结茧率/%Percentage of cocooning/%化蛹率/%Percentage of pupation/%空白对照 Control601.667±2.89c98.33±2.89a98.33±2.89ab1.00×10-3605.000±5.00c95.00±5.00a98.33±2.89ab3.05×10-36010.00±5.00c90.00±0.00a100a1.04×10-26010.00±0.00c90.00±5.00a98.13±3.23ab2.74×10-26035.00±10.0b65.00±10.0b93.00±6.67b7.98×10-26065.00±5.00a35.00±5.00c85.50±2.11c
2.3 甲氧虫酰肼对家蚕的初级风险评估
2.3.1 家蚕初级暴露分析
甲氧虫酰肼（24%悬浮剂）在我国登记的田间最大施药剂量为0.108 kg·hm-2，施用次数最多为2次，施药间隔为7 d。根据1.3.1，对甲氧虫酰肼进行2次施药的初级暴露分析。甲氧虫酰肼在桑叶上的降解半衰期（DT50）采用默认值10 d，甲氧虫酰肼最后一次使用距离桑叶采收的间隔期（PHI）采用默认值1 d，根据1.3.1中公式计算得到甲氧虫酰肼在桑叶上的降解系数（DFPHI）为0.933。单位面积农药施用量（AR）取0.108 kg·hm-2，甲氧虫酰肼在桑树上第95百分位的单位残留量（RUD95）采用默认值950 （mg·kg-1）/（kg·hm-2），根据1.3.1中公式计算得到2次施药的施药因子（MAF）为1.616，最外围一行桑树上的飘移因子（PDFfr）采用默认值9.8%，次外围一行桑树上的飘移因子（PDFsr）采用默认值0.6%，根据1.3.1式（1）和式（2），计算得到最外围桑树上的预测暴露浓度（PECma-fr）和次外围桑树上的预测暴露浓度（PEC ma-sr）分别为15.2 mg·kg-1和0.928 mg·kg-1。
2.3.2 家蚕初级效应分析
由于甲氧虫酰肼作用缓慢，以168 h-LC50为急性毒性终点（EnP），根据2.1的结果（表1）可知，EnP为0.134 mg·kg-1，不确定性因子（UF）取70，根据1.3.1式（3）计算得到预测无效应浓度（PNEC）为1.91×10-3 mg·kg-1。
图2 甲氧虫酰肼对家蚕主要经济性状指标的影响
注：图中数据经Duncan新复极差法检验，同组数据后不同字母表示在0.05水平具有显著差异；图中的药剂浓度是以药剂与桑叶的质量比计算得其实际的暴露浓度。
Fig. 2 Effect of methoxyfenozide on main economic characteristics of silkworm
Note: The data in the figures are tested by Duncan’s new multiple range method; different letters after the same group of data indicate that there are significant differences at the level of 0.05; the pesticide concentration in the figures is the actual exposure concentration calculated according to the mass ratio of pesticide to mulberry leaf.
2.3.3 家蚕高级效应分析
根据2.2的家蚕慢性毒性试验得出最大无作用浓度（NOEC）为3.05×10-3 mg·kg-1（以甲氧虫酰肼对家蚕茧层量无影响的NOEC），UF取7，根据1.3.1式（4）计算得到PNEC为4.36×10-4 mg·kg-1。
2.3.4 家蚕初级和高级风险表征
PECma-fr和PEC ma-sr分别为15.2 mg·kg-1和0.928 mg·kg-1，根据1.3.3式（5），PNEC为1.91×10-3 mg·kg-1，计算得到初级风险RQ（最外围）为7 937，次外围RQ为486。PNEC为4.36×10-4 mg·kg-1，计算得到高级风险RQ（最外围）为34 771，次外围RQ为2 128。根据初级风险和高级风险评估结果，在飘移场景下，甲氧虫酰肼在目前登记的田间最高施用剂量下无论是以最外围桑树的桑叶饲喂家蚕还是以次外围桑树的桑叶饲喂家蚕，对家蚕的风险均不可接受（RQ>1）。
3 讨论（Discussion）
甲氧虫酰肼属于昆虫生长调节剂，在农田中其施用方法主要是喷雾法[1]。根据我国农业行业标准《农药登记 环境风险评估指南 第5部分: 家蚕》（NY/T 2882.5—2016）[14]，农药对家蚕慢性毒性染毒主要采用的是浸叶法和定量喷雾法。为了使研究结果更接近实际田间情况，本研究采用定量喷雾法测定甲氧虫酰肼对家蚕二龄幼虫的急性毒性和慢性毒性效应。已有学者研究发现采用食下毒叶法测定的24%甲氧虫酰肼悬浮剂对家蚕二龄幼虫96 h-LC50值为0.600 （0.530～0.680） mg·L-1，根据我国农业行业标准《化学农药 家蚕慢性毒性试验准则》（NY/T 3087—2017）中提到的浓度单位修正系数[13]，可以转换为0.280 （0.240～0.310） mg·kg-1，这显著低于本研究中报道的甲氧虫酰肼对家蚕二龄幼虫的96 h-LC50值0.715 （0.509～1.17） mg·kg-1，其原因可能在于本研究采用的是甲氧虫酰肼原药，而以往的研究采用的是甲氧虫酰肼制剂。根据我国国家标准《化学农药环境安全评价试验准则 第11部分: 家蚕急性毒性试验》（GB/T 31270.11—2014）中的农药对家蚕毒性分级标准[15]和上述农业行业标准中提到的浓度单位修正系数，本研究测定的甲氧虫酰肼对家蚕96 h至168 h-LC50值处于高毒-剧毒级别。
家蚕接触微量慢性毒性较大的农药后，虽然死亡率很低或者无死亡，但蚕体正常的生长发育和生理代谢受到干扰，造成眠蚕体质量下降、眠起不齐或发育历期延长等，同样会给养蚕业造成较大的经济损失。因此，预防农药污染引起的家蚕慢性毒性效应也非常重要[16-17]。本研究进行的甲氧虫酰肼对家蚕的慢性毒性研究表明，甲氧虫酰肼在极低的浓度时，对家蚕的生长发育和经济学性状指标均产生了不同程度的影响，且随着桑叶上的甲氧虫酰肼含量的增加，各龄眠蚕体质量、结茧率、全茧量、茧层量和茧层率呈现逐渐下降的趋势，尤其是结茧率下降明显。甲氧虫酰肼处理浓度与家蚕的各项经济学性状指标均呈负相关。处理药剂浓度越高，对家蚕的生长发育和主要经济性状的影响程度也越大，与对照组相比差异性也越显著。因此，甲氧虫酰肼对家蚕具有极强的慢性毒性效应。
农药生态风险评估是在毒性效应测试的基础上，关注农药对整个生态系统直接或间接的影响，是将孤立的环境行为、环境生态和对非靶标生物的毒性资料等进行整合，科学判定农药的生态风险，从而更科学、直观地反映农药在使用过程中对环境影响的实际情况，是评价农药安全性的有效技术手段，具有重要的现实意义[18]。在农药管理较为先进的国家和组织，生态风险评估是农药登记管理的必需环节，以风险评估结果为主要依据做出登记决策[11,19]。因此，农药生态风险评估不仅仅是管理者的技术工具，在农药登记管理、风险监测等方面将发挥重要作用，同时，如将风险评估技术贯穿于新农药的研发过程，及时发现新化合物对人和环境的潜在毒性风险，可以有效预防新药剂研发风险。
考虑到甲氧虫酰肼作用较慢，本研究进行的甲氧虫酰肼对家蚕风险评估中初级效应分析时采用急性毒性最高的试验结果（168 h-LC50）的急性毒性终点来进行毒性等级评定和风险评估，更能准确反映该杀虫剂对家蚕的毒性效应和风险。在急性毒性和慢性毒性研究的基础上，根据我国农业行业标准《农药登记 环境风险评估指南 第5部分: 家蚕》（NY/T 2882.5—2016）[14]针对甲氧虫酰肼喷雾使用后对家蚕的影响进行初级风险评估：在飘移场景中，甲氧虫酰肼在目前登记的田间最高施用剂量下喷施，桑树最外围的初级风险RQ为7 937，桑树次外围的初级风险RQ为486。当初级风险RQ>1时；根据慢性试验得出的毒性终点（NOEC）为3.05×10-3 mg·kg-1（甲氧虫酰肼对家蚕茧层量无影响的NOEC），进行了高级风险评估，结果表明桑树最外围的高级风险RQ为34 771，桑树次外围的高级风险RQ为2 128。说明无论是以最外围桑树的桑叶饲喂家蚕还是以次外围桑树的桑叶饲喂家蚕，对家蚕的风险远远不可接受（RQ>1）。鉴于甲氧虫酰肼对家蚕具有很强的急性毒性、慢性毒性效应和不可接受的风险。因此，建议养蚕期间，蚕区及周围农田禁止使用甲氧虫酰肼防治害虫。
本研究较为系统地评价了甲氧虫酰肼对家蚕的毒性效应，为该药剂在蚕区的科学使用提供了参考，这对养蚕业的安全生产和稳定发展具有重要指导作用。尽管已有报道部分农药对家蚕中肠内肠道微生物和干扰免疫系统的研究[20]，但迄今为止，以家蚕的一些生理生化和分子水平指标作为环境污染的生物标志物的研究仍然不够深入。笔者建议，今后需要更加关注高风险农药对家蚕的亚致死效应、毒性的生化和分子机制以及农药联合暴露的影响，以期为科学合理使用化学农药，减少其对家蚕的毒副作用，实现蚕业生产的可持续发展奠定理论基础。
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