油泥样品。1）除油微生物菌剂组成优化及影响因素分析的油泥样品，采自东营某油井周围污染土壤，土壤呈暗褐色，含水率为35%，含油率为29%。2）油泥微生物处理小试实验、油泥处理组合工艺小试及中试实验的油泥样品，取自潍坊某石油炼化厂油水储罐的污泥沉淀层，含水率约为96%，呈暗黑色，污泥固相颗粒细小，粘度高且脱水效果差，总石油含量为10%~30%（以污泥干重计）。

菌种取自实验室，选取以往实验及工程应用证实对石油烃具有高效破乳或降解作用的菌种，分别是柴油食烷菌（Alcanivorax dieselolei）、皮氏解环菌（Cycloclasticus pugetii）、威尼斯不动杆菌（Acinetobacter venetiana）、季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）、除烃海杆菌（Marinobacter hydrocarbonoclasticus）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。为了与其它市售除油菌剂产品比较，选取美国Bioworld公司的除油产品（BioWorld Hydrocarbon Treatment products），购于Bioworld官网。该产品由2部分组成，一部分是液体菌剂：提高微生物在危险废物环境（土壤或水）的繁殖能力。另一部分是固体菌剂：生物强化菌种。

柴油食烷菌、皮氏解环菌和除烃海杆菌培养采用2216E培养基：乙酸钠（CH₃COONa）5 g、胰蛋白胨5 g、酵母提取物1.0 g、柠檬酸铁（Ferric Citrate）0.1 g、氯化钠（NaCl）19.45 g、氯化镁（MgCl₂）5.98 g、硫酸钠（Na₂SO₄）3.24 g、氯化钙（CaCl₂）1.8 g、氯化钾（KCl）0.55 g、碳酸钠（NaHCO₃）0.16 g、溴化钾（KBr）0.08 g、氯化锶（SrCl₂）0.034 g、硼酸（H₃BO₃）0.022 g、硅酸钠（Na₂O·nSiO₂）0.004 g、氟化钠（NaF）0.002 4 g、硝酸钠（NaNO₃）0.001 6 g、磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）0.008 g、1 L蒸馏水，pH值7.6±0.2。威尼斯不动杆菌、短小芽孢杆菌和季也蒙毕赤酵母培养采用LB培养基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化钠（NaCl）10 g、1 L蒸馏水、pH值7.0±0.1。无菌操作接种上述菌种于灭菌培养基，在恒温培养箱28 ℃、150 r·min⁻¹ 培养3 d，OD₆₀₀约2.2，此时菌液处于生长稳定期，菌体活性及数量处于最佳状态。

1）含水率。去除油泥样品中大块异物（石子、树枝等），最大程度确保测定样品的代表性。将具盖容器和盖子于（105±5） ℃下反复烘干4 h至恒重，干燥器冷却后测定带盖容器的质量m₀；再取适量油泥样品转移至已称重的具盖容器中，测定总质量m₁；将带盖容器和油泥样品一并放入烘箱中，在（105±5） ℃下反复烘干4 h至恒重，置于干燥器中冷却，取出后立即测定带盖容器和烘干油泥的总质量m₂。油泥含水率计算如式(1)所示，测定结果精确至0.1%。

2）总石油含量。将油泥样品风干除去异物，称取0.5 g风干的油泥样品，研磨成粉状，再分别称取3 g无水硫酸钠和3 g硅酸镁吸附剂于100 mL具塞锥形瓶中。在锥形瓶中加入20 mL四氯乙烯，置于震荡器中，以200 r·min⁻¹振荡萃取20 min。静置 10 min 后，在玻璃漏斗上放置一层专门过滤石油烃萃取液的玻璃纤维滤纸，将提取液过滤至50 mL具塞比色管中。再用20 mL四氯乙烯重复萃取一次，重复上述操作。最后再用10 mL四氯乙烯润洗锥形瓶、滤膜和分液漏斗。最后使用红外分光光度计在 2 930、2 960、3 030 cm⁻¹处测量四氯乙烯萃取液吸光度，具体测定步骤参考《土壤石油类的测定—红外分光光度法》（HJ 1051-2019）^[20]。总石油烃含量ρ₁（mg·L⁻¹）如式(2)所示，油泥总石油含量$ {w}_{\mathrm{油}} $如式(3)所示（以油泥干重计）。

式中：ρ₂为萃取液石油烃浓度，mg·L⁻¹；V为萃取液体积，mL；m为风干油泥样品质量，g；W_水为风干油泥样品含水率，%。

3）臭气浓度。总烃、甲烷、非甲烷总烃（NMHC）的检测根据《固定污染源废气总烃、甲烷和非甲烷总烃的测定—气相色谱法》（HJ 38-2017）^[21]采用Thermofisher Trace1310-ISQLT气相色谱仪进行分析。色谱分析条件为：色谱柱温度80 ℃，检测器温度220 ℃，辅助加热区温度100 ℃，氢气流量40 mL·min⁻¹，空气流量400 mL·min⁻¹。非甲烷总烃含量=总烃含量－甲烷含量。总烃的标准曲线如式(4)~(5)所示，甲烷的标准曲线如式(6)~(7)所示。

式中：f(x)为面积；x为浓度；R²为判定系数。

4）高通量测序。取2份石油炼化厂油水储罐油泥，一份原始样品，另一份投加相应的营养盐物质、不投加菌剂进行曝气3 d后取样，送至上海美吉生物医药公司进行测序。数据分析在美吉生物云平台（https://cloud.majorbio.com）上进行，具体如下：采用mothur软件（http://www.mothur.org/wiki/Calculators）计算Alpha多样性指数。

1）除油微生物菌剂组成优化及影响因素分析。油泥样品为东营某油井周围污染土壤，含水率为35%，含油率为29%。采用摇瓶实验进行研究，除其它地方特别说明外，锥形瓶内加入75 mL菌液，175 mL蒸馏水，5 g干态油泥，121 ℃灭菌20 min。于恒温摇床28 ℃、150 r·min⁻¹处理7 d。分析处理后油泥含油量时，从摇瓶取50 mL样品，风干样品后称取0.5 g泥样进行分析检测。每组实验重复3次。

不同菌种的油泥处理效果比较。选取实验室6种高效石油降解菌，分别为威尼斯不动杆菌、季也蒙毕赤酵母菌、除烃海杆菌、短小芽孢杆菌、柴油食烷菌、皮氏解环菌，与市售美国石油降解菌剂进行比较。此外，对照实验分别为：空白实验A（不投加菌液及氮、磷、铁等营养盐）；空白实验B（不投加菌液，但投加氮、磷、铁等营养盐）。

菌种复配处理油泥的方法如下。选取优势菌种进行不同比例的搭配，5种配比方案如下（按菌液体积比）：M1为50% 柴油食烷菌+50%皮氏解环菌；M2为75% 柴油食烷菌+25% 皮氏解环菌；M3为25% 柴油食烷菌+75%皮氏解环菌；M4为25%威尼斯不动杆菌+25%季也蒙毕赤酵母菌+25%除烃海杆菌+25%短小芽孢杆菌；M5为6种菌种等比例组成。

对于影响因素的分析方法如下。首先是温度，考虑到工程应用的实际情况，研究选取温度范围为10~40 ℃，温度梯度为5 ℃。针对处理时间，锥形瓶内反应液总体积为500 mL，其中150 mL菌液，350 mL蒸馏水，10 g干态油泥，于恒温摇床28 ℃、150 r·min⁻¹处理15 d，每隔3 d取25 mL样品进行含油量分析检测。针对油泥投加量的影响，研究根据每100 mL反应液分别投加1、2、3、5、7、10 g干态油泥进行比较分析。

2）油泥微生物处理小试装置。结构如图1所示，集搅拌、曝气、撇油功能。小试装置有效容积2 L，反应器尺寸为长20 cm×宽10 cm×高15 cm。处理装置采用序批式运行，油泥和菌液一次性投入，然后启动搅拌机和曝气泵，达到设定反应时间后，停止搅拌和曝气，浮在水面的油层由刮油板撇除。曝气量由气体流量计控制，池体溶解氧浓度大于2 mg·L⁻¹；搅拌机转速100 r·min⁻¹；室温运行（20~25 ℃）。

3）生物滤池除臭装置。设置2组反应器来验证除油菌剂的除臭功能，一组是颗粒活性炭和已经将菌剂进行挂膜的填料，另一组则是颗粒活性炭和未添加菌剂的填料。如图2所示，该装置是由2个相同的生物滤池组成，滤池底部放置多孔填料将菌剂固定，上部则是颗粒活性炭层。2个滤池的水层通过蠕动泵循环流动，提高水相溶解臭气的生物去除率。反应器密封，空床停留时间18 min，处理3 d，曝气量500 mL·min⁻¹，油泥处理反应器产生的臭气由真空泵导入臭气处理生物滤池。臭气样品的取样是在反应器稳定运行一段时间后再进行取样，取样时间根据油泥的处理时间而定，在每个油泥处理批次的第1、2、3 d分别取进气口和出气口的气体样品进行检测。

1）单菌实验。摇瓶实验处理7 d后，测定各实验的油泥含油量，结果如图3（单菌）所示。空白实验A的总石油去除率为5.9%，尽管未接种菌且没有添加营养盐。由于摇瓶剧烈震荡，一部分油会从油泥表面脱附，形成油层浮于水面；相比之下，空白实验B在添加了营养盐后石油去除率略有提高，达到11.2%。可能是油泥本身含有一些土著菌，在营养物充足条件下能够繁殖，进而降解石油或促使石油从油泥表面脱附。尽管土著菌具有石油降解功能，但是其降解能力有限，仅通过投加营养盐的方式不能取得满意的处理效果，这意味着生物刺激（Biostimulation）^[22]效果有限，需要进行生物强化（Biogaugmentation）^[23]，因此引入外源菌种。

不同菌种的油泥处理效果存在明显差异，其中柴油食烷菌细菌表现出最佳的处理效果，其石油去除率达到50.3%；皮氏解环菌细菌次之，去除率为43.4%；再者是美国菌剂，去除率为33.9%。其他组去除率小于30%。柴油食烷菌细菌实验组观察到，水相上部形成一层紧密的油层，推测这是油泥处理过程中柴油食烷菌细菌产生表面活性物质，使高度乳化的石油破乳凝结，浮出水面并凝结成层，利于回收^[24]。皮氏解环菌细菌处理体系也有浮油出现，但没有凝结成层，呈现分散油颗粒。需要指出的是，美国石油降解菌剂的处理效果远逊于柴油食烷菌细菌和皮氏解环菌细菌，且无明显浮油层，该产品是油污土壤修复的菌剂产品，可能不适高含油污泥的处理。

2）复合菌株。为了进一步提高油泥处理效果，选择了摇瓶实验中表现最为高效的2个菌种（柴油食烷菌细菌和皮氏解环菌细菌）进行不同比例的混合，从而确定最优种群结构配比。结果如图3（复合菌株），随着柴油食烷菌细菌占比的增加，总石油去除率逐渐升高，配比方案M2（柴油食烷菌细菌占75%）的总石油去除率为52%。然而，当6种菌等比例混合时（方案M5），较为高效的柴油食烷菌和皮氏解环菌细菌无法形成竞争优势，导致处理效果较差。实验结果表明，柴油食烷菌细菌以破乳为主，使油与泥得到有效分离，有助于高效回收石油资源；而皮氏解环菌细菌以降解为主，有助于水相溶解油和乳化油的降解，处理后含油水可直接排放到厂区污水处理站，由于含油量低，减轻对污水处理设施的冲击。与单独使用柴油食烷菌细菌的处理效果相比，配比方案M2的总石油去除率提升有限，但是该方案含油水的油含量显著降低，仅为12 mg·L⁻¹，较单独柴油食烷菌细菌处理下降了60%。

综上所述，在油泥处理中，微生物主要通过破乳作用达到油分离，从而实现高达70%的石油回收率。在后续研究中，油泥处理的菌剂配方采用方案M2，即75%柴油食烷菌细菌+25%皮氏解环菌细菌。

分别从温度、处理时间、油泥的投加量这3个因素分析对微生物处理油泥的影响，结果如图4所示。首先，随着温度的升高，石油烃的降解率先升高后下降，相同处理时间的剩余石油含量在25 ℃时最低。这主要是因为温度提高有利于菌群的生长繁殖，促进表面活性剂产生，并且提高石油降解相关酶的活性^[25-26]。当温度降至15 ℃时，微生物机体代谢活力降低，此时发挥主要作用的可能为初始菌液中表面活性剂，菌群降解能力受到抑制；当温度降至10 ℃，菌群活力下降更为严重，生长繁殖基本停滞，处理效果下降更为明显，所以对于北方冬季的油泥处理工程，建议采取室内操作，必要时加热。同时发现，当温度超过35 ℃甚至更高时，对除油微生物产生不利影响。考虑到使用的菌种属于中温菌，最适生长温度为20~30 ℃，与油泥处理最佳温度范围基本一致。总体而言，实验使用的菌剂具有较宽泛的温度使用范围，基本符合工程应用的现场温度条件。

其次考察了处理时间的影响，由于初始菌群处于稳定期，投加的菌液积累了大量胞外酶和表面活性剂，因此处理3 d后的总石油去除效率相对可观，达到36.2%；6 d时总石油去除率有显著提升，达到46.2%；随后继续增加处理时间，去除率提升缓慢乃至停滞，可能是因为菌群已经将油泥中容易吸收降解的油份消耗殆尽，剩余的复杂有机物和部分中间产物此菌群无法继续对其产生作用。微生物法以成本低、无二次污染和操作简单等优点备受关注，但由于处理周期过长、时间成本过高，导致实际应用不多^[27-28]。故处理时间是需要考察的重要因素，处理时间直接影响处理设备体积，采用合理的处理时间能够减少设备体积，降低工程基建投资。综合处理效果和处理时间，7 d左右的生物修复时间较为合理。

此外，比较了不同干态油泥投加量对菌剂降解石油的影响。当每100 mL反应液投加油泥质量为3 g及以下时，处理7 d后石油去除效果较好，总石油去除率为50%左右，剩余石油含量在13%左右。继续增加油泥投加量，总石油去除率逐渐下降，降至25%左右。随着油泥投加量的增加，达到同一去除率需要的处理时间延长，可能预设7 d的时间不足以有效去除石油组分。也可能是，菌群受油泥所含的复杂有害物质影响逐渐加深，菌群活性受到抑制，降解能力发挥有限，发挥主要作用的仅为菌液初始投加时已经存在的胞外物质。考虑到多数采油工艺需投加大量化学试剂，不同油田的含油污泥成分复杂，含有大量不利于微生物生长甚至毒害作用的有机物及重金属离子^[29]。此外，相同体积菌液及相同处理时间前提下，油泥投加量会影响设备处理能力和运行费用，故100 mL反应液中油泥投加量在3 g以下时最佳。

首先，对曝气前后的原始炼化油泥微生物进行Alpha多样性分析，Alpha多样性分析主要通过多个多样性指数来评估环境样本中微生物群落的丰富度和多样性，常用的度量标准有Sobs、Ace、Chao、Shannon、Simpson和Coverage等。表2中A1为曝气前的原始油泥样品，A2为仅通过曝气处理3 d后的油泥样品。其中，两组样品Coverage均大于0.99，即表明所收集到的基因序列能够很好地代表微生物群落。Sobs、Ace、Chao指数均表示微生物群落的丰富度，通过对比A1和A2丰富度指数发现，曝气处理后的样品微生物群落丰富度降低，这可能是由于油泥罐长期处于封闭厌氧状态，通过好氧处理并不能激活土著微生物，环境条件的改变导致微生物丰富度降低。同时从Shannon和Simpson指数可以看出油泥样品多样性在曝气后也呈现下降趋势，Shannon指数越高表示多样性越大，Simpson越高多样性越低，3 d后Shannon指数从5.065 1降至3.820 4，Simpson指数从0.015 61增至0.101 37。因此，通过浮油回收过程中的气浮作用对油泥中土著微生物产生的生物刺激效果有限，这也意味着额外投加适应该环境的好氧石油降解菌进行生物强化尤为重要。

其次，探究油泥与菌液体积比直接影响设备的处理能力，分别选取菌液与油泥体积比2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，考察其对油泥处理效果的影响。由图5(a)可知，当菌液与油泥体积比为2∶1、1∶1时，总石油去除率均维持高值，高于50%。继续增加油泥体积占比，总石油去除效果急剧下降。当菌液与油泥体积比为1∶2时，总石油去除率降至20%；菌液与油泥体积比1∶3时，总石油去除率降至12%。油泥体积增加，微生物处理负荷加重，短时间内不能消耗增加的污染负荷，导致处理效率下降。考虑运行成本与处理效果，宜选取菌液与油泥体积比为1∶1。

最后，通过投加菌剂验证曝气与不曝气的对比实验，油泥与菌液体积比为1∶1，处理时间7 d，结果如图5(b)所示。曝气与不曝气的处理效果差异明显，总石油去除率相差20%。曝气能够加快油滴上浮便于撇除浮油，同时曝气促进好氧微生物的代谢能力。曝气能增强菌液的破乳作用，3 d时曝气组已无明显浮油产生，而未曝气组仍继续缓慢浮油，故曝气可缩短处理时间。最终，在曝气条件下处理3 d的浮油回收率为12%左右，而未曝气处理7 d的浮油回收率仅为4%。

为了验证该复合菌剂的石油烃臭气降解能力，设计了1组对照实验，实验数据如表3所示。2组反应器初始进气浓度一致，来自同一油泥处理密闭反应器产生的臭气，分别取第1、2、3 d进气样和出气样分析臭气降解率。可以看出添加菌剂的NMHC降解效果明显优于不添加菌剂组。在进气NMHC浓度相同的情况下，第1 d添加菌剂组的出气NMHC浓度为109 mg∙m⁻³，而未投加菌剂组的出气NMHC浓度为235 mg∙m⁻³，NMHC降解率从55.07%提升至79.16%；第2、3 d投加菌剂组仍表现出更高效的NMHC降解率，降解率分别从40%上升至76.16%、30.87%上升至64.06%，说明菌剂的投加能提升25%以上的NMHC降解率。

除臭生物滤池运行一段时间后（约10 d），再对其进行取样分析，如图6所示。进气和出气NMHC含量的变化和总烃含量变化成正相关，进气中总烃含量几乎与NMHC含量持平，出气中总烃含量与NMHC含量则有一定的差值，而甲烷含量微乎其微，由此可以看出在处理后的气样中NMHC在总烃中的占比明显降低。从出气口NMHC的浓度可以看出，连续运行4个批次，每个批次处理3 d，每批次出气口NMHC的浓度基本上降至120 mg∙m⁻³以下，满足石化行业规定的石油炼制工业污染物排放标准（GB 31570-2015）^[30]，其中NMHC的排放量<120 mg∙m⁻³，说明该菌剂在20 d内可持续发挥除臭作用。而在个别天数则出现异常现象，第三批次和第四批次的第1 d出气口NMHC浓度分别为225和148 mg∙m⁻³，此时达不到排放要求，可能是由于进气口臭气浓度增大，需要增加臭气在反应器停留时间以及在反应器水相中添加营养物质，这与LEE等^[31]研究结果一致，因此维持反应器更长时间的稳定运行，仍需进一步研究。

1）油泥处理组合工艺小试实验。以复合菌剂预处理含油污泥为主体，构建了“微生物降解-气浮-Fenton氧化-离心脱水-低温热处理”组合工艺。在微生物降解阶段，主要作用机制是由菌剂产生表面活性剂，促使油泥中的油、泥、水3相分离，形成小油滴，随后气浮阶段使小油滴聚集成大油滴，最终形成浮油层。在静置半小时后，对上层的浮油进行撇除。结果如图7所示，微生物处理1 d后形成油滴，但油、水、泥尚未很好分离；微生物处理2 d时油水泥3相有分离但静置后的水相依很浑浊，处理3 d时可见油水泥3相明显分离，并且水层浊度低，处理效果好。这一阶段经过微生物降解及曝气预处理，油泥含油率从29%降到16%，去除率接近50%。

微生物降解+气浮预处理后的沉淀油泥继续由Fenton氧化、离心脱水、低温热处理进行深度处理。Fenton氧化的主要药剂费用取决于过氧化氢投加量，控制反应时间2 h，初始pH为4，H₂O₂/Fe²⁺摩尔比=20。初始油泥含油率为6.3%，过氧化氢投加量为5 000、11 000、22 000 mg∙L⁻¹，对应的处理后含油率分别为5.1%、2.5%、3.1%。采用超声波强化Fenton氧化以期实现含油率降至0.3%以下，Fenton（11 000 mg∙L⁻¹ H₂O₂、2 h）+常温超声波（超声波处理时间1 h）、Fenton+高温超声波（50 ℃、1 h）处理后的含油率分别为2.7%、2.3%，可见超声波强化并不能显著提升油泥处理效率。此外，将Fenton与过硫酸钾氧化联合处理含油污泥，H₂O₂和K₂S₂O₈投加量分别为11 000、30 000 mg∙L⁻¹，Fenton（2 h）+K₂S₂O₈氧化（2 h）、Fenton（2 h）+K₂S₂O₈氧化（2 h）+加热处理（100 ℃、2 h）处理后的含油率分别为1.6%、1.3%。Fenton与过硫酸钾联合氧化看似能够显著提升油泥处理效果，但是深入分析发现K₂S₂O₈溶解度低混入油泥导致油泥质量增大，从而减少单位质量油泥中的石油烃含量，30 000 mg∙L⁻¹过硫酸钾加入量差不多将油泥质量增加1倍，因此Fenton与过硫酸钾联合氧化未能提升油泥总石油烃去除率。

最终选择Fenton氧化阶段选择过氧化氢投加量为11 000 mg·L⁻¹，结果如图8所示，处理后的含油率为从16%降到2.5%。之后进行离心脱水后，离心脱水含油率从2.5%降到2.2%，此阶段只降低了0.3%的含油量。最后一个阶段是对油泥进行热处理，选择3个温度进行热处理，200 ℃加热处理2 h、300 ℃加热处理2 h、500 ℃加热处理2 h，其含油率分别降至0.25%、0.18%、0.1%。由此可见低温热处理选择200 ℃条件下处理 2 h较为经济，即可达到处理后含油率≤0.3%的行业标准。

2）油泥处理组合工艺中试实验。每个批次处理1 m³油泥，菌剂投加量为油泥体积的10%，依次通过微生物降解处理3 d、气浮15 min、Fenton化学氧化2 h、离心脱水、低温热处理2 h。气浮后撇除油层，沉淀的水层作为菌剂循环水。处理结果如图9所示，经微生物处理和气浮大约可以回收15%初始油泥体积的浮油；离心脱水发现，投加PAM和不加PAM的处理油泥样品不存在明显差异，因此可直接进行离心脱水。从表4可以看出，通过“微生物处理+气浮+化学氧化”处理后的2个批次油泥样品的含油率分别降至1.125%、0.937 5%，而通过“微生物处理+气浮+化学氧化+低温热处理”处理后的含油率则分别降至0.21%、0.07%，因此含油污泥的低温热处理对达到含油率小于0.3%的排放标准是十分必要的。最终形成以下工艺参数，如表5所示，处理后的泥沙用于建材、建筑地基等，处理后污水排入市政污水管网或厂区污水处理站。

本研究以含油污泥高效微生物处理为目标，优化除油菌剂菌种组成及操作条件，同时考察除油菌剂对石油烃臭气的处理能力。构建“微生物降解-气浮-Fenton氧化-离心脱水-低温热处理”新型油泥无害化处理组合工艺，初步确定工艺参数。得出以下结论。

1）除油菌剂最佳配比方案为75%柴油食烷菌+25%皮氏解环菌（菌液体积比）。适宜温度范围20~30 ℃，干态油泥（含水率35%）处理量为每100 mL反应液投加3 g以下油泥，较佳处理时间为7 d，可实现50%左右除油率。

2）除油菌剂与活性炭组合具有良好的石油烃臭气处理能力，生物滤池空床停留时间18 min，NMHC含量降至120 mg∙m⁻³以下，去除率介于60%~80%之间。

3）通过含油污泥处理小试和中试实验，确定了“微生物降解-气浮-Fenton氧化-离心脱水-低温热处理”组合工艺，处理后含油率≤0.3%。工艺参数如下：菌剂投加量为油泥体积的10%（湿态油泥，含水率96%），微生物处理3 d，Fenton氧化2 h，H₂O₂投加量为11 000 mg·L⁻¹，H₂O₂/Fe²⁺摩尔比=20，1 500 r·min⁻¹离心脱水20 min，200 ℃低温热处理2 h。