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水蛭为水蛭科动物蚂蝗（Whitmaniapigra Whitman）、水蛭（Hirudonipponica Whitman）或柳叶蚂蝗（Whitmania Acranulata Whitman）的干燥全体，具有破血通经、逐瘀消癥等功效，临床上具有很高的药用价值[1]. 针对水蛭药材，采用液相色谱法对其进行黄嘌呤、尿苷、尿嘧啶、次黄嘌呤中1—4种碱基及核苷成分的含量测定已有相关文献报道[2 − 4]. 碱基是嘌呤和嘧啶的衍生物，是合成核苷、核苷酸和核酸的基本组成单位. 核苷是是核酸合成的前体，具有保护神经、抗病毒和抗菌等生物活性. 李桃运用多种色谱分离手段从水蛭中提取并分离鉴定出38个化合物[5]，荆文光等从水蛭甲醇提取物中分离鉴定了18个化合物[6]，除上述4种成分外，还包含其他几种成分，如腺苷、腺嘌呤、次黄嘌呤苷（肌苷），但未均建立此类成分的含量测定方法.
水蛭配方颗粒是由水蛭饮片经水加热提取、浓缩、干燥、制粒而成的一种颗粒. 目前，水蛭配方颗粒暂未出台相应的国家药品标准，广东、山东、湖南等地公布了水蛭配方颗粒的省级质量标准，这些标准中含量测定项主要涉及抗凝血活性、水蛭胺C、次黄嘌呤的测定. 除此之外，未见水蛭配方颗粒中多种碱基和核苷成分同时测定的相关报道. 碱基和核苷化合物绝大部分是强极性的小分子，仅依靠传统的疏水作用机制难以进行较好的色谱保留，该类化合物也一直是分析技术的难点. 本试验通过多重保留机制的液相色谱-质谱联用技术，建立同时快速测定水蛭配方颗粒中7种碱基和核苷类成分的含量方法，该方法具有分析快速、准确、灵敏度高的特点，可为水蛭配方颗粒甚至水蛭药材的质量评价提供依据.
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试剂：尿嘧啶、次黄嘌呤、腺苷、腺嘌呤、肌苷对照品（上海源叶生物科技有限公司），黄嘌呤对照品（中国食品药品检定研究院），尿苷对照品（上海安谱实验科技有限公司），纯度均大于98%. 水蛭配方颗粒来源于广东一方制药有限公司，每袋1.5 g，每1 g配方颗粒相当于2 g药材.
仪器：超高效液相色谱仪Nexera X2与三重四极杆质谱LCMS-8050联用系统（岛津，日本）.
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混合标准溶液的制备：精密称取7种碱基和核苷对照品各适量，除黄嘌呤用20 mmol·L−1氢氧化钠溶解外，其余均采用10%甲醇溶液溶解，最终用10%甲醇溶液配制成系列浓度的混合标准溶液，待上机分析.
样品前处理：取水蛭配方颗粒5袋，研细，称取约0.1g（精确到0.0001g），加入10%的甲醇溶液100 mL，涡旋混匀1 min，50 ℃超声30 min，4000 r·min−1离心10 min，上清液用0.22 μm的尼龙滤膜滤过，取续滤液即得. 样品的稀释：精密量取制备好的样品续滤液1 mL，用10%甲醇溶液定量稀释至10 mL.
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液相色谱条件：色谱柱为Discovery®HS F5-3（150 mm×2.1 mm, 3 μm），流动相：A为0.15%甲酸水溶液，B为甲醇；流速0.35 mL·min−1，梯度洗脱，0—1min，2%—5%B，1—5 min，5%B—50%B，5—5.5 min，50%B—90%B，5.5—7 min，90%B，7.01—10 min，2%B；柱温40 ℃，进样体积：1 μL.
质谱条件：ESI正负离子模式同时监测；接口电压：+0.5 kV（正离子），−0.5 KV（负离子）；雾化气流速：氮气3.0 L·min−1；加热气流速：空气15 L·min−1；干燥气流速：氮气5 L·min−1；脱溶剂管温度：150 °C；加热模块温度：300 °C；离子源接口温度：350 °C；扫描模式：多反应监测（MRM）；驻留时间：25 ms；MRM参数见表1．
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依据待测化合物的溶解性及参考相关文献[4，7]，本实验尝试了使用水、10%甲醇、70%甲醇、0.1%甲酸及10 mmol·L−1氢氧化钠在50 ℃下进行超声提取30 min，考察不同溶剂的提取效率. 结果显示：70%甲醇、0.1%甲酸及10 mmol·L−1氢氧化钠提取条件下，肌苷的峰面积偏低，且70%甲醇提取条件下色谱峰会展宽. 水和10%甲醇对大部分化合物的提取效率相当，但10%甲醇对腺苷的提取效率要优于水. 综合考虑，确定样品溶液的制备方式为10%甲醇50 ℃条件下超声30 min.
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本实验曾比较了不同流动相系统对色谱峰及质谱响应的影响，如乙腈－0.02%甲酸和1 mmol·L−1乙酸铵水溶液、乙腈－0.1%甲酸水溶液、甲醇－0.1%甲酸水溶液、甲醇－0.15%甲酸水溶液. 最后确定采用甲醇－0.15%甲酸水溶液的流动相体系，该体系下各化合物色谱保留较好且质谱信号较强.
7种待测碱基和核苷化合物的属于极性较强的化合物，传统反相色谱保留效果欠佳. 董萌等尝试用亲水色谱对食品中的碱基、核苷和核苷酸类物质进行色谱保留[8]. 亲水色谱对强极性化合物保留较好，但要得到较好的峰形和重复性，方法开发的难度往往比普通反相色谱的难度要大. 本实验对比了Discovery®HS F5-3、Shim-pack GIST C18和ShimNex UP C18色谱柱对分析测试的影响. 结果显示Discovery®HS F5-3色谱柱对待测化合物的保留最好，且质谱响应信号相对更高. Discovery®HS F5-3是一款在硅胶基质上键合了五氟苯基的色谱柱，提供了疏水作用、氢键作用、离子作用等多重保留机制，对强极性化合物的保留和异构体的分离优于常规C18柱.
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将10 ng·mL−1的混合对照品溶液连续进样６次，尿苷、肌苷、腺苷、次黄嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶和黄嘌呤7种化合物测得峰面积的RSD分别为4.50％、5.83％、1.84％、3.35％、4.27％、2.08％、3.54%，表明精密度良好.
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取系列浓度的混合标准溶液上机测定，以对照品浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）绘制校准曲线，得到7种碱基和核苷的线性方程、判定系数. 以各化合物信噪比（S/N）约为３时计算对应的浓度为检出限（LOD），各对照品信噪比（S/N）约为10时对应的浓度为定量限（LOQ），结果如表2所示. 由表2可知，7种碱基和核苷在相应的浓度范围内具有良好的线性关系，判定系数（R2）≥0.996，检出限在0.13—1.18 μg·g−1范围内，定量限在0.43—3.94 μg·g−1范围内，该方法灵敏度较高.
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取“1.3”项下样品溶液上机测定，以外标法计算7种碱基和核苷的含量. 尿苷、肌苷、腺苷、次黄嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶和黄嘌呤的含量分别为41.42、7.11、1.24、314.87、4.89、55.83、53.95 μg·g−1. 本品中尿苷、次黄嘌呤、尿嘧啶和黄嘌呤的含量相对较高，肌苷、腺苷和腺嘌呤有检出，但含量较低. 另精密称取已测知含量的水蛭配方颗粒约0.1ｇ，精密加入适量的对照品储备液，按“1.3”项方法制成加样回收样品溶液，平行制备6份. 进行次黄嘌呤回收率测试时，将以上加样回收样品溶液稀释10倍上机进行测定，外标法计算平均回收率，结果见表3. 7种碱基和核苷的平均回收率在87.09%—105.81%之间，RSD%在1.35%—4.70%之间，表明方法的准确性高.
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高浓度混合标准溶液（1000 ng·mL−1）分析完成后，进样10%甲醇试剂空白，考察残留情况. 结果表明，7种碱基和核苷化合物检测通道中均无明显目标化合物干扰.
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本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪Nexera X2和三重四极杆质谱仪LCMS-8050 联用测定水蛭配方颗粒中7种碱基和核苷成分的分析方法. 该方法分析速度快，重复性好，灵敏度和准确度较高，适合水蛭配方颗粒中碱基和核苷类化合物的快速定量检测，可为水蛭配方颗粒的质量评价提供参考.
基于LC-MS/MS技术的水蛭配方颗粒中7种碱基和核苷成分分析方法的建立
Establishment of analytical methods for nucleobase and nucleosides of leech formula granule by LC-MS/MS
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摘要: 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪Nexera X2和三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用测定水蛭配方颗粒中7种碱基和核苷成分的分析方法. 水蛭配方颗粒以10%甲醇50℃超声提取30 min，MRM正负模式同时检测. 以Discovery®HS F5-3色谱柱进行分离，流动相为0.15%甲酸水溶液和甲醇，10 min内完成梯度洗脱. 本方法采用外标法定量，7种化合物在相应的浓度范围内线性关系良好，判定系数（R2）均大于0.996，定量限在0.42—3.94 μg·g −1之间. 10 ng·mL−1的混合标准品溶液连续进样6次，待测化合物峰面积RSD均小于6%，精密度良好. 平行6份加标回收试验，7种化合物平均回收率在87.09%—105.81%之间，RSD%在1.35%—4.70%之间. 残留实验结果为阴性. 该方法准确可靠，可为水蛭配方颗粒的质量控制提供参考依据.Abstract: An analytical method was established for simultaneous determination of 7 nucleobase and nucleoside components in leech formula granule by a combination of Shimadzu ultra-high performance liquid chromatography Nexera X2 and triple quadrupole mass spectrometry LCMS-8050. Leech formula granule was extracted by ultrasound at 50 ℃ with 10% methanol for 30 minutes, and detected with MRM mode by both positive and negative ESI ionization. Discovery®HS F5-3 column was used for separation, with a mobile phase consisted of 0.15% formic acid aqueous solution and methanol. Gradient elution was used within 10 minutes. External standard method was used for quantification. The seven compounds had good linear relationships within the corresponding concentration range, all coefficient of determination (R2) were greater than 0.996, and the quantification limit was between 0.42 μg·g −1and 3.94 μg·g −1. The 10 ng·mL-1 mixed standard solution was injected 6 times, and the peak area RSD of tested compounds was all less than 6%, indicating good precision. The recovery experiments executed for six times, the average recovery of 7 compounds was ranged from 87.09% to 105.81%, with RSD% ranging from 1.35% to 4.70%. The residual test result was negative. This method is accurate and reliable, and can provide a reference for the quality control of leech formula granule.
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Key words:
- LC-MS/MS /
- leech /
- formula granule /
- nucleobase /
- nucleosides.
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表 1 7种碱基和核苷的MRM参数列表
Table 1. MRM parameters for 7 nucleobases and nucleosides
化合物 前体离子 产物离子 Q1预杆偏差/V 碰撞电压/V Q3预杆偏差/V 极性 尿苷 245.1 113.1* −27.0 −10.0 −19.0 正 70.0 −17.0 −33.0 −13.0 肌苷 269.1 110.0* −29.0 −42.0 −17.0 正 137.1 −30.0 −12.0 −28.0 腺苷 268.1 136.1* −19.0 −22.0 −29.0 正 119.1 −30.0 −45.0 −11.0 次黄嘌呤 136.9 110.1* −30.0 −23.0 −18.0 正 55.0 −30.0 −31.0 −21.0 腺嘌呤 136.1 64.9* −30.0 −39.0 −26.0 正 92.0 −14.0 −30.0 −14.0 尿嘧啶 113.0 70.0* −27.0 −17.0 −24.0 正 96.1 −26.0 −21.0 −19.0 黄嘌呤 151.1 107.9* 16.0 19.0 10.0 负 79.9 30.0 23.0 29.0 注: * 代表定量离子对. 
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表 2 7种碱基和核苷的线性范围及灵敏度
Table 2. Linear range and sensitivity of 7 nucleobases and nucleosides
化合物 浓度范围/（ng·mL−1） 线性方程 判定系数R2 定量限/（μg·g−1） 检出限/（μg·g −1） 尿苷 2—500 Y = （4638.13）X + （-1899.49） 0.997 1.59 0.48 肌苷 1—100 Y = （3051.64）X + （2020.53） 0.998 0.42 0.13 腺苷 1—100 Y = （223740）X + （11509.4） 0.996 0.70 0.21 次黄嘌呤 1—100 Y = （14727.4）X + （2659.38） 0.996 0.43 0.13 腺嘌呤 1—100 Y = （14903.4）X + （479.220） 0.998 0.87 0.26 尿嘧啶 5—1000 Y = （1000.35）X + （−1777.53） 0.997 3.94 1.18 黄嘌呤 2—1000 Y = （1267.59）X + （−308.937） 0.998 1.42 0.43
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表 3 7种碱基和核苷的加样回收率（n=6）
Table 3. The recovery data of 7 nucleobases and nucleosides
化合物 加标量/μg 平均回收率/% 相对标准偏差/% 尿苷 5.0 88.38 3.72 肌苷 3.0 105.81 4.70 腺苷 3.0 87.09 3.72 次黄嘌呤 40 99.11 1.77 腺嘌呤 3.0 85.46 1.35 尿嘧啶 5.0 91.06 4.64 黄嘌呤 5.0 92.80 4.36
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