超高效液相色谱−串联质谱法同时检测工业大麻中8种大麻酚的含量

李俊生; 王学峰; 姜冰; 张盼盼; 王派丽; 王妍; 周春卫; 吴岩

哈尔滨商业大学食品工程学院，哈尔滨，150028

哈尔滨海关技术中心，哈尔滨，150028

岛津企业管理（中国）有限公司，沈阳，110016

Simultaneous determination of 8 cannabinols in industrial hemp by ULTRA performance liquid chromatography-Tandem mass spectrometry

School of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin, 150028, China

Harbin Customs Technical Center, Harbin, 150028, China

Shimadzu( China) Co., LTD. ，Shenyang, 110016, China

摘要: 本文建立了超高效液相色谱−串联质谱（UPLC-MS/MS）法测定工业大麻中8种大麻酚的检测方法. 样品经烘干后用无水乙醇超声提取，采用QuEChERS方式净化，经Luna Omega 1.6 μm Polar C18（100 mm×2.1 mm）色谱柱分离，以5 mmol乙酸铵和乙腈为流动相进行梯度洗脱，电喷雾负离子模式进行离子扫描，多反应监测模式下测定8种大麻酚，内标法定量. 在0—10 μg·kg⁻¹内，线性相关系数（R²）均大于0.999，方法检出限为0.02—0.15 μg·kg⁻¹，定量限为0.08—0.50 μg·kg⁻¹，在添加水平为1 LOQ、5 LOQ和10 LOQ时的回收率在89.9%—104.7%，相对标准偏差（RSD）在0.9%—4.1%.

Abstract: A method for the determination of 8 cannabinol in industrial hemp by ULTRA-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) was established. After drying, the samples were extracted by ultrasonic extraction with anhydrous ethanol, purified by QuEChERS method, and separated on a Luna Omega 1.6 μm Polar C18 (100 mm×2.1 mm) column. Gradient elution was performed with 5 mmol ammonium acetate and acetonitrile as mobile phase, and ion scanning was performed in electrospray negative ion mode. Determination of 8 cannabinol under multiple response monitoring mode. THC-D3 was used as internal standard and quantified by internal standard method. The linear correlation coefficients (R²) of the method were greater than 0.999 in the range of 0—10 μg·kg⁻¹, the limits of detection were 0.02—0.15 μg·kg⁻¹, and the limits of quantification were 0.08—0.50 μg·kg^-1. The recoveries at 1 LOQ, 5 LOQ and 10 LOQ levels ranged from 89.9% to 104.7%, and the relative standard deviations (RSD) ranged from 0.9% to 4.1%.

Key words:

industrial hemp /
cannabidiol(CBD) /
tetrahydrocannabinol (THC) /
Ultra High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)

化合物

母离子（m/z）

子离子（m/z）

锥孔电压/V

碰撞能量/eV

保留时间/min

THCVA

329.30

217.20^*，285.20

−35

−30

1.37

CBDA

357.20

107.00^*，339.20

−40

−25

1.82

THCA

357.30

245.10^*，313.20

−25

−30

1.67

CBGA

359.40

315.40^*，341.30

−50

−20

1.59

CBN

309.30

222.00^*，279.20

−20

−45

3.01

THC

313.26

191.20^*，245.10

−65

−25

3.27

CBD

313.34

179.10^*，245.10

−55

−20

2.64

CBG

315.30

136.03^*，191.08

−60

−25

2.57

THC-D3

316.20

194.10*，248.10

−70

−28

3.26

　　*表示定量离子对

化合物

检出限/（μg·kg⁻¹）

定量限/（μg·kg⁻¹）

全文HTML

工业大麻是指四氢大麻酚（THC）含量低于0.3%的大麻，大麻酚是工业大麻中最重要的化学成分，其中包括大麻酚（CBN）、大麻二酚（CBD）、四氢大麻酚（THC）及其异构体等. 目前，对植物大麻酚的分析方法主要有气相色谱法（GC）^[1-2]、高效液相色谱法（HPLC）^[3-4]、高效液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），其他技术包括薄层色谱（TLC）、核磁共振（NMR）和近红外光谱（NIR），这些方法都有其优点和缺点. GC是分析大麻提取物中植物大麻酚最常用的方法，但是，GC分析所需的高温触发了植物大麻酚的酸形式的脱羧，这种分解阻碍了新鲜样品中主要化合物的检测，且存在化合物相关动力学，从而影响了的定量. 此外，高温还可引发其他反应，如氧化和异构化. HPLC灵敏度低、受基质干扰较大，如果使用紫外检测，色谱必须考虑选择性，以避免其他吸收紫外线的化合物的干扰. TLC技术具有快速、简便、廉价等优点，但灵敏度和选择性不如主流技术. NMR具有灵敏、适合定量分析的特点，但价格昂贵. NIR是快速鉴别的方法，不适合定量分析的方法. 高效液相色谱法-串联质谱（LC-MS/MS）法分析范围广、选择性好、灵敏度高、分析结果可靠，因此，本实验采用高效液相色谱法-串联质谱法同时检测8种大麻酚，检测时间仅为5 min，有效提高检测效率和适用范围，为我国工业大麻的监管提供了重要的技术手段.

1. 材料与方法

1.1. 仪器与试剂

UFLC-MS /MS 液相色谱-串联质谱仪（Nexera XＲ液相色谱仪LC-30A由日本岛津公司生产，AB6500+质谱仪由美国 ABI 公司生产），飞诺美Luna Omega 1.6 μm Polar C18（100 mm×2.1 mm）色谱柱，Thermo Fisher高速冷冻离心机，EYELA 分液漏斗振荡器，KQ-500DB型数控超声波清洗器.

大麻酚标准品：四氢大麻酚（THC）、大麻二酚（CBD）、大麻萜酚（CBG）、大麻酚（CBN）、四氢大麻酚-D3（THC-D3）、大麻二酚酸（CBDA）、四氢大麻酚酸（THCA）、四氢次大麻酚酸（THCVA）、大麻萜酚酸（CBGA），9种大麻酚标准品均来自于阿尔塔公司（天津）. 质谱级甲酸（赛默飞，美国），质谱级乙腈、甲醇（Fisher），乙酸铵，色谱级正己烷. QuEChERS净化管（Waters公司）：含150 mg N-丙基乙二胺（PSA）和900 mg无水硫酸镁. 工业大麻样品：工业大麻的花、叶、茎秆和种子均来自于黑龙江省.

1.2. 标准溶液配制

精密称取THC、CBD、CBG、CBN、THC-D3、CBDA、THCA、THCVA、CBGA标准品溶液，用甲醇分别稀释成10 mg·L⁻¹单标储备液，置于棕色储液瓶中，-18 ℃冷冻避光保存. 用甲醇稀释得到浓度为0—10 μg·L⁻¹的系列标准工作液，内标物THC-D3浓度为5 μg·L⁻¹.

1.3. 前处理方法

将工业大麻样品在55℃烘箱中干燥12 h后进行研磨，研磨后称取样品1.0 g（精确到0.01 g）于50 mL离心管中，准确加入50 μL内标中间液THC-D3， 10 mL无水乙醇，涡旋混合5 min后，超声处理30 min，10000 r·min⁻¹离心5 min，提取上清液5 mL待净化.

将5 mL提取液置于装有N-丙基乙二胺（PSA）填料150 mg、无水硫酸镁900 mg的净化管中，用手剧烈震荡提取1 min，10000 r·min⁻¹离心3 min，取上清液1 mL过0.22 μm有机系滤膜过滤，供UPLC-MS/MS测定.

1.4. 分析条件

色谱条件：Luna Omega 1.6 um Polar C18（100 mm×2.1 mm）色谱柱，柱温40 ℃；流速0.25 mL·min⁻¹；进样体积5 μL. 流动相A：5 mmol乙酸铵；流动相B：乙腈. 洗脱梯度：0—0.5 min，50%B；0.5—0.8 min，50%—10%B；0.8—4 min，10%B；4.0—4.1 min，10%—50%B；4.1—5.0 min，50%B.

质谱条件：电喷雾负离子模式（ESI-）；毛细管电压2.5 kV；锥孔电压65 V；脱溶剂气温度150 ℃；源温度150 ℃；脱溶剂气流量500 L·h⁻¹；气帘气流量50 L·h⁻¹. 8种大麻酚及内标物采集方式进行分段采集，0—2.2 min检测采集THCVA、CBDA、THCA、CBGA；2.2—5 min检测采集CBN、THC、CBD、CBG、THC-D3. 8种大麻酚及内标物MRM检测参数信息见表1.

2. 结果与讨论

2.1. 方法优化

2.1.1. 样品前处理方法优化

提取液选择乙腈、无水乙醇、乙酸乙酯、正己烷进行比较. 由于大麻酚的化学极性相对较强，无水乙醇和乙腈极性强于乙酸乙酯和正己烷，但由于乙腈经济成本较无水乙醇高，综合考虑选用无水乙醇作为提取溶剂. 比较了震荡和超声提取方式，超声30 min时，大麻酚提取效率最高，因此，提取方式选择超声30 min.

2.1.2. 色谱柱的选择

比较了Waters ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm（2.1 mm×50 mm）、Waters Atantis^TM T3 3 μm（2.1 mm×50 mm）和飞诺美 Luna Omega 1.6 μm Polar C18（100 mm×2.1 mm）. Waters C18色谱柱对于酸性类大麻酚响应值较好（CBDA、CBGA、THCA、THCVA），但其他大麻酚响应值较低（CBD、CBN、THC、THC-D3），CBG未有响应. Waters Atantis^TM T3色谱柱可以较好的分离9种大麻酚，但THC-D3响应值较低. 飞诺美 Luna Omega 1.6 μm Polar C18色谱柱能够全部分离出9种大麻酚，且响应值较高，因此色谱柱选择飞诺美 Luna Omega 1.6 μm Polar C18.

2.1.3. 流动相优化

流动相比较了乙腈-5 mmol乙酸铵、乙腈-水、甲醇-水和甲醇-5 mmol乙酸铵，结果发现, 乙腈-水带羧酸基团的大麻酚峰展宽，峰型拖尾；甲醇-水带羧酸基团的灵敏度提高，但其他大麻酚灵敏度下降；甲醇-0.5 mmol乙酸铵所有大麻酚灵敏度整体下降，综合考虑响应值，选取乙腈-0.5 mmol乙酸铵.

2.2. 净化方法的确定

工业大麻样品基质复杂，其中含有较多的叶绿素、糖类和脂类. 提取液中干扰杂质较多，因此需要对提取液进行净化. 选用了C18 、HLB、Carb-NH₂ SPE和QuEChERS四种净化方式，C18对于烃类、油脂吸附效果较为明显，对于复杂基质净化效果一般. HLB能够对油脂、蛋白、磷脂有较好的吸附效果，但对于颜色较深的色素复杂基质效果一般. Carb-NH₂ SPE和QuEChERS两种净化方法能够取得较好的回收率，对于色素、糖类等有较好的吸附效果，但Carb-NH₂ SPE需要活化、淋洗固相萃取柱等前处理过程，样品处理时间较长，因此选择QuEChERS净化方式.

2.3. 标准曲线与检出限

配制8种大麻酚质量浓度分别为0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg·L⁻¹的系列混合标准液，进样体积5 μL， 5.0 μg·L⁻¹THC-D3为内标物. 以8种大麻酚与THC-D3的质量浓度比为横坐标，8种大麻酚与THC-D3的色谱峰面积的比作为纵坐标建立标准曲线. 以3倍信噪比（S/N）和10倍信噪比（S/N）计算检出限（LOD）及定量限（LOQ），结果表明，8种大麻酚在线性范围0—10 μg·L⁻¹均有良好的线性关系，相关系数（R²）均大于0.999（表2）.

2.4. 方法的回收率及精密度

对已知8种大麻酚含量的工业大麻样品中添加标准物质浓度为1倍定量限、5倍定量限、10倍定量限的标准溶液中间液，按照1.3节前处理过程进行加标回收实验，每个样品分为花叶、茎秆、种子做6次水平. 扣除样品本底值得到每种大麻酚回收率及相对标准偏差，如表3所示，其中THCVA的平均回收率为92.4%—102.3%，精密度为1.3%—3.5%. THCA的平均回收率为91.7%—103.3%，精密度为0.9%—3.9%. THC的平均回收率为92.1%—100.2%，精密度为 1.1%—4.1%. CBG的平均回收率为91.0%—104.9%，精密度为1.9%—3.5%. CBGA的平均回收率为90.6%—98.5%，精密度为1.8%—4.0%. CBN的平均回收率为93.4%—98.6%，精密度为1.1%—3.7%. CBD的平均回收率为91.1%—104.7%，精密度为1.4%—3.1%. CBDA的平均回收率为89.9%—98.5%，精密度为0.9%—4.1%. 结果表明方法精密度良好.

2.5. 实际样品检测

采用本方法对同一产地的6个不同地块的工业大麻样品进行检测，其中CBDA含量为 3.1422%—4.5512%，CBD含量为0.0474%—0.1053%，THC含量为0.0021%—0.0067%，THCA含量为0.0838%—0.1243%，CBG含量为0.0067%—0.0112%，CBGA含量为0.0923%—0.1783%，CBN含量为0.0014%—0.0043%，THCVA含量为0.0072%—0.0212%，其中THC含量＜0.3%，符合工业大麻THC含量标准.

3. 结论

本文建立了一种超高效液相色谱-三重四级杆质谱法同时检测工业大麻样品中四氢大麻酚、大麻二酚、大麻萜酚、大麻酚、大麻二酚酸、四氢大麻酚酸、四氢次大麻酚酸、大麻萜酚酸的检测方法，检测时长仅为5 min. 该方法具有检测大麻酚种类多、检测时间短，能够准确的对大麻酚进行定性、定量的优点. 对于方法学考察研究具有良好的准确性、精密度和稳定性，为我国工业大麻的研究提供了有力的技术支撑.

参考文献 (4)

[1]	CIOLINO L A, RANIERI T L, TAYLOR A M. Commercial cannabis consumer products part 1: GC–MS qualitative analysis of cannabis cannabinoids [J]. Forensic science international, 2018, 289: 429-437. doi: 10.1016/j.forsciint.2018.05.032
[2]	BARANAUSKAITE J, MARKSA M, IVANAUSKAS L, et al. Development of extraction technique and GC/FID method for the analysis of cannabinoids in Cannabis sativa L. spp. santicha (hemp) [J]. Phytochemical Analysis, 2020, 31(4): 516-521. doi: 10.1002/pca.2915
[3]	BRIGHENTI V, PELLATI F, STEINBACH M, et al. Development of a new extraction technique and HPLC method for the analysis of non-psychoactive cannabinoids in fibre-type Cannabis sativa L. (hemp) [J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2017, 143: 228-236. doi: 10.1016/j.jpba.2017.05.049
[4]	CHANG C W, TUNG C W, TSAI C C, et al. Determination of cannabinoids in hemp nut products in Taiwan by HPLC‐MS/MS coupled with chemometric analysis: quality evaluation and a pilot human study [J]. Drug Testing and Analysis, 2017, 9(6): 888-897. doi: 10.1002/dta.2062