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由于气候变化影响自然环境和人类文明，温室气体的研究受到广泛关注[1-2]。CH4排放后20年尺度内增温效应是CO2的84倍[3]。因此，CH4比CO2具有更强的温室效应。2023年4月，美国国家海洋和大气管理局(NOAA)监测数据显示CH4浓度已经达到1.37 mg·m3且未来将持续增长，而湿地CH4排放量占全球总量的20%~39%[4]，湿地中植物根系代谢物或植物残体会转变成产甲烷微生物的底物，为CH4的产生创造有利条件[5]。因此，控制湿地CH4排放对减缓全球气候变暖至关重要。
生物氧化是抵消CH4产生的一个关键过程，其中甲烷氧化菌对氧化CH4有主导作用[6]。为进一步了解甲烷氧化菌对湿地CH4减排的贡献，各地学者对甲烷氧化菌进行了系列研究，在微生物群落多样性、丰度及分布特征方面取得阶段性进步。YANG等[7]发现滇池淡水湖中甲烷氧化菌群主要由甲基球菌(Methylococcus)、甲基杆菌(Methylobacter)和甲基弯曲菌(Methylosinus)组成，而Type Ⅰ型甲烷氧化菌的数量通常多于Type II型。邓永翠团队自2013年开始研究青藏高原地区土壤微生物群落组成[8]，表明优势甲烷氧化菌群是甲基杆菌和甲基孢囊菌(Methylocystis)，但它们的分布会受到环境因素差异的影响[9]。而铁是地球上含量第四丰富的元素，并且普遍存在于湖泊沉积物中，但针对于富铁环境中甲烷氧化菌的群落结构及关键驱动因素的研究还鲜见报道。此外，研究表明在缺少氧分子的情况下甲烷氧化菌可以利用铁、锰等作为电子受体[10]，ETTWIG等[11]通过使用13C标记甲烷进行批量培养，证明了可溶性铁Fe(Ⅲ)可作为电子受体支撑CH4氧化活性，并且将之前发现的依赖铁的甲烷厌氧氧化过程与在许多湿地检测到的微生物联系起来，很好地解释了铁和甲烷生物循环之间的相互作用。但细胞不能直接利用氧化铁将通过胞外电子传递途径生物还原氧化铁，如导电毛(e-pili)、多血红素细胞色素(MHCs)和电子穿梭[12]。ELUL等[13]研究表明微生物群落可能通过多血红素c型细胞色素或微生物纳米导线(Microbial nanowires)将电子直接转移到细胞外矿物质。LI等[14]认为甲烷氧化菌将甲烷转化为乙酸等低分子量有机物时会分泌电子穿梭体，可以将胞内的电子传递到胞外被胞外的Fe(III)接受。然而，利用铁离子作为甲烷氧化菌的替代电子受体的微生物机制及其生态贡献尚不明确。但已有研究证明甲烷氧化菌能够将CH4转化成CO2或者同化为细胞生物量[15]，氧化沉积物中产生的90%甲烷[16]。因此，利用甲烷氧化菌治理散排甲烷无非是一种潜在的绿色方案。
本研究以牟尼沟草海湿地为研究对象，基于高通量测序技术对湿地中甲烷氧化菌的群落特征进行研究，结合关键环境驱动因素分析和功能预测分析，进一步讨论了草海湿地中甲烷氧化菌群落结构及其功能代谢特性。并从中筛选出一株代表性甲烷氧化菌，探究了该菌株在富铁溶液中铁离子变化趋势、胞外产物分析及对甲烷的氧化效率，为湿地甲烷减排提供参考。
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草海(32°65′~32°70′E, 103°44′~103°49′N)位于黄龙国家重点风景名胜区内。该地区空气稀薄，气温低寒，每年5月开春解冻，9月起气温急剧下降并开始下雪。年平均降水量700 mm，年最大降雨量为1 500 mm，5~9月较集中，降雨量可达31.9 mm·h−1。年平均气温5~7 ℃，最冷的1月份平均气温3 ℃。最高海拔4 250 m，最低海拔2 800 m。
采样区域(5~10 cm的沉积物)内选取3个采样点分别是CH-1、CH-2、CH-3(图1)，每个样点选取0.5 m×0.5 m作为1个样方采用五点采样法，去除植物残根、细石之后将5个沉积物混为一个样品，每个采样点做3个平行。其余样品装入50 mL灭菌离心管后冷藏处理并立即带回实验室进行分析测试。
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采用便携式多参数测定仪对上覆水pH、氧化还原电位(ORP)进行现场测量，电感耦合等离子体发射光谱仪(ICAP-6500)分析水体中的金属元素，离子色谱(ICS-900)分析水体中的阴离子浓度，总氮(TN)采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法(GB 11894-89)，总磷(TP)由钼酸铵分光光度法(GB 11893-89)测定。沉积物样品采用硝酸微波消解法(HJ 766-2015)进行消解，再利用ICP分析对沉积物中的金属元素含量，总有机碳分析采用TOC测试仪。
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沉积物样品经预处理后送往天津诺禾致源生物信息科技有限公司进行第二代高通量测序。使用无菌水将样品稀释至1 ng·μL−1，采用CTAB法提取样品的总基因组DNA，在1%琼脂糖凝胶上监测DNA浓度和纯度。使用引物对341F(5´CCTACGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5´GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)扩增细菌16S rRNA基因的高变区V3-V4。所有PCR反应均用15µL Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs)进行，正向和反向引物各2 µM，模板DNA约10 ng。热循环包括98 ℃初始变性1 min, 98 ℃变性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s的30个循环，最后72 ℃保温5 min。将等量的1X缓冲液(SYB green)与PCR产物混合后在2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。PCR产物按等密度比混合，然后用Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen, Germany)纯化混合PCR产物。再使用truseq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit (Illumina, USA)生成测序文库，并添加索引代码。用Qubit@ 2.0荧光仪(Thermo Scientific)和Agilent Bioanalyzer 2100系统评估文库质量。最后，在Illumina NovaSeq平台上对文库进行测序。
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分离纯化时选用NMS培养基[17]。取10 g原位采集的沉积物与离子水充分震荡、混匀备用。取上清液10 mL于含有100 mL灭菌培养基的盐水瓶中，在厌氧培养箱中进行厌氧处理，丁基翻边胶塞密封。并用注射器瓶内置换100 mLCH4气体，在150 r·min−1、25 ℃恒温摇床中进行富集培养。之后每24 h置换100 mLCH4气体，待培养基浑浊后取5%菌液接种于灭菌的盐水瓶中，如此重复3代以上[18]。
取对数生长期菌液10 mL离心，经天津诺禾致源生物信息科技有限公司进行一代序列测定后，所得基因序列与NCBI-BLAST数据库获得的核苷酸序列进行同源性比较，确定甲烷氧化菌株种属[19]。
取FeCl3·6H2O 0.28 g溶于50 mL去离子水中，按照1%接种量用0.22 µm滤膜接入培养基中，做3组平行。定期采用邻菲啰啉分光光度法(HJ/T 345-2007)测定菌液中Fe(Ⅱ)与Fetotal的浓度变化。
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为研究菌株生长过程中分泌的胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)组份变化，选取了第3、7、15 天的样品进行三维荧光光谱分析，并对每天的平行样品通过Matlab软件进行平行因子分析。样品处理：取菌液1 ml用去离子水稀释5倍之后采用高速离心机6000 r·min−1，5 min对样品进行预处理取上清液进行测定。采用荧光分光光度计(F7000，HITACH，Japan)测量三维荧光。荧光强度在激发波长为200~500 nm，增量为5 nm，发射波长为200~500 nm，增量为5 nm的条件下测量，扫描速度为 12 000 nm·min−1。
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取对数增长末期的菌液按5%的比例接种于灭菌培养基中，厌氧培养箱中氮气处理。注射器置换瓶内气体，通过气相色谱测量甲烷浓度初始值后放于恒温摇床中培养，并在第3、5、7 d之后再次测量样品中甲烷含量。气相色谱仪(VarianGC450，American)，外标法定量测定甲烷浓度。色谱条件为HP-AL/S(25 m×0.320 mm)；部件号19091P-S12；进样口温度120 ℃；柱温箱100 ℃，20 min；进样器，180 ℃；检测器FID，200 ℃；采用分流进样，分流比10:1；柱流量1.5 mL·min−1；载气为N2；进样体积0.5 mL。
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序列分析采用Uparse软件(Uparse v7.0.1001, http://drive5.com/uparse/)。相似度≥97%的序列被分配到相同的OTU。筛选每个OTU的代表性序列进行进一步注释同时生成不同分类水平的物种丰度表。软件平台Home (biomicroclass.com)对甲烷氧化菌与环境因子进行冗余分析(RedundancyAnalysis，RDA)。使用MEGA 7.0软件构建系统发育树、Matlab软件对三维荧光光谱图进行平行因子分析。
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由表1可见，草海上覆水pH为7.57~7.89，总体上呈弱碱性，ORP在165.4~179.3 mV，NO3−为1.336~1.425 mg·L−1，SO42−为4.157~7.079 mg·L−1，TN在1.839~1.952 mg·L−1，TP为0.505~1.083 mg·L−1。沉积物中TOC为148.6~198.7 mg·g−1，Mn为0.810~1.626 mg·g−1。自然湿地(0~40 cm)Fe含量均值为22.41 mg·g−1[20]，而草海沉积物中Fe含量达到155.136~186.450 mg·g−1，高出自然湿地铁含量的6~8倍，表明草海是一个富铁湿地。
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对草海湿地微生群落所有序列进行注释，如图2(a)所示，其中含有甲烷氧化菌的菌门按相对丰度从高到低依次为变形菌门(Proteobacteria, 30.7%)、放线菌门(Actinobacteria, 5.61%)、疣微菌门(Verrucomicrobiota, 2.07%)，其中变形菌门为草海湿地优势菌群。在种水平图2(b)上，相对丰度较高的甲烷氧化菌分别是长柄甲基杆菌(Methylobacterium_brachiatum，0.28%)与脱氮甲基单胞菌(Methylomonas_denitrificans，0.17%)。此外还发现了兼性甲基营养型细菌的一种新物种Labrys_methylaminiphilus[21]。有研究[22]表明，变形菌(Proteobacteria)和疣微菌(Verrucomicrobiota)是高寒湿地中的优势菌门，ELUL等[13]表明天然的富铁湖泊沉积物中甲基单胞菌(Methylomonas)与Methylotenera为优势甲烷氧化菌，另外，研究[23]表明，甲基杆菌(Methylobacter)是高寒湿地中优势甲烷氧化菌群。因此，变形菌门中的Type Ⅰ型甲基杆菌对草海富铁湿地中甲烷减排有较高的贡献度。
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RDA分析可在二维图上直观反映反应微生物群落与环境因素的关系[24]。图3(a)所有理化因素在RDA1轴上的投影显示，pH、ORP和NO3−是影响甲烷氧化菌群落组成的主要环境因素。其中pH与疣微菌呈正相关与变形菌呈负相关，ORP与疣微菌呈负相关，与变形菌呈正相关，Fe和NO3−与变形菌和疣微菌呈正相关。说明草海湿地生态系统中的变形菌与疣微菌对O2的适应性存在差异[25]。在图3(b)所示在种水平上，pH、ORP和TP是影响甲烷氧化菌群落组成和多样性的主要环境因素。总体而言，pH和ORP是影响草海甲烷氧化菌群落组成和多样性的关键驱动因素。尽管目前在特殊环境中也发现了甲烷氧化菌的存在[26]，但在pH(5.44~6.10)相对较低的土壤中，甲烷氧化菌主要是Type II型甲基囊菌，而在pH(7.02~8.02)较高的土壤中Type I型的甲基杆菌占主要[27]。因此，在草海偏碱性沉积物环境中Type Ⅰ型甲烷氧化菌会更占优势。OPR是继pH之后另一个影响因素，研究表明微生物种间电子传递能形成共生关系[28]，将铁这种外源物质引入微生物生境中会促进Pseudomonas、Bacillus等细菌的代谢，将通过胞外电子传递途径生物还原氧化铁[29]。此外研究者们发现海洋沉积物中的甲烷氧化菌能够以铁矿作为电子受体通过金属还原与甲烷氧化结合的新途径氧化甲烷[30]。由此，甲烷氧化菌能够利用铁矿作为替代电子受体的代谢潜力为富铁湿地中甲烷减排提供了新的方向。
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对草海沉积物样品中微生物功能进行FAPROTAX注释预测，得到75种生态功能。如图4所示，这些功能主要集中在C循环、N循环、S循环、人类疾病和铁呼吸。如图5所示，将前10优势功能进一步分析。其中甲烷代谢、甲基代谢、发酵、硝酸盐还原和铁呼吸占比较高。VOROBEV等[31]研究表明甲烷氧化菌反应体系中碳通过丝氨酸和核糖酮二磷酸途径被同化，氮则通过对氧敏感的固氮酶固定，从而证实了甲烷氧化菌具有参与氮循环功能的潜力。CHANDLER等[32]研究表明与化能异养有关的OTU也存在与其他过程有关，如甲烷代谢和甲基代谢。此外，铁呼吸在草海富铁环境中对微生物群落功能影响是一个特别的存在，铁呼吸又称异化铁还原是指微生物以胞外不溶性铁氧化物为末端电子受体，通过氧化电子供体耦合Fe(Ⅲ)还原。CABROL等[33]也报道了甲基杆菌与反硝化菌在缺氧湖泊中能积极氧化CH4并参与铁循环。此外，在OTU数据集中也发现了铁氧化细菌的存在，如纤毛菌(Leptothrix mobilis)和泉发菌(Crenothrix polyspora)，由此说明草海富铁环境中可能存在甲烷氧化菌耦合其他微生物发生复杂的铁氧化还原反应，功能分析也同步表明甲烷代谢与铁呼吸在代谢库中占比明显，但参与其反应的微生物机制还需进一步探究。
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将鉴定后的甲烷氧化菌序列与NCBI-BLAST数据库获得的核苷酸序列进行同源性比较构建系统发育树，如图6。菌株与Methylobacterium sp.CBMB35相似性为98%，初步鉴定菌株属于甲基杆菌属。将菌株命名为Methylobacterium sp. D-C1，后文中以C1代替。如图7(a)所示测试了菌株C1细胞在缺氧、CH4存在与否的情况下以Fe(III)作为潜在电子受体的反应情况。在CH4存在的情况下观察到在7 d的反应过程中，Fe(II)的含量持续增加。在没有甲烷或C1细胞的条件下Fe(II)浓度没有显著增加。结果表明，甲基杆菌C1在甲烷存在下能够以Fe(III)作为电子受体，其前3 d的Fe(II)累积量约为2 mg·L−1，20 d后累积达到16 mg·L−1。如图7(b)所示探究了反应体系菌株C1、Fe(III)与CH4体系中Fe(II)、Fe(III)与Fetotal的变化趋势。VAN等[34]研究表明各种细菌排泄的细胞外聚合物物质(EPS)可作为溶解Fe(II)和Fe(III)氢氧化物的初始吸附剂。Fetotal的下降的趋势可能是菌株对铁的吸附导致的。以上结果表明，在缺氧条件下甲基杆菌C1能够以FeⅢ作为电子受体支撑对于甲烷的氧化，但具体的胞外产物作用规律还需要进行后续分析。
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三维荧光光谱图可分为Ⅰ~Ⅴ区域[35]。由图8可知，检测出的物质分别在II区(Ex/Em=220~250nm/330~380nm)、IV区(Ex/Em =250~450nm/280~380nm)。II区为色氨酸类蛋白与类芳香蛋白物质，易被生物降解，此蛋白质类物质有利于促进甲烷氧化耦合反硝化过程微生物的形成和稳定[36]。IV区代表溶解性微生物代谢副产物，无氧条件时会为厌氧类细菌提供物质和能量进行硝化反应[37]。随着反应的进行色氨酸类蛋白物质再第7d时不在增加，而分泌代谢产物随着反应时间的增加而不断增多。通过Matlab软件进一步对胞外组分进行分析，表明除了II、IV区物质外还有V区(Ex/Em=250~450 nm/380~550 nm)的类腐殖质物质的产生(图9中组分C3)。类腐殖质荧光峰主要的结构特征是羧基和羟基，主要来源于类富里酸和类腐殖酸。腐殖酸被认为是可以接受和释放电子的电子穿梭体，微生物和电极之间的电子转移可以由腐殖酸物质来完成[38]。此外，腐殖酸带负电与铁、铝等金属离子具有较高的亲和力[39]。Fe(III)先与腐殖质组分络合，再与酯键合、醌型环、芳族基团、脂肪族基团和酚基反应[40]。因此，在反应过程中菌株通过分泌的腐殖质将胞内电子转移到胞外再与Fe(III)结合，使得Fe(III)成为甲烷氧化菌的电子受体。
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如图10所示Fe(Ⅲ)可以与CH4反应而消耗(CH4+8Fe3++2H2O → 8Fe2++8H++CO2)，但17 ℃时甲烷在水中的溶解度为3.5 mg，导致这种化学反应效率很低。添加菌株C1培养3 d后可氧化67.8%的甲烷气体，5 d后甲烷氧化率达到了85%。添加Fe(Ⅲ)作为电子受体后3 d内甲烷的氧化效率提高了8.6%，5 d后的氧化效率提高了10.8%左右，7 d内能够完全氧化瓶内的甲烷气体。有研究[41]表明，在高甲烷低氧条件添加富铁炭或可有效缓解胞外聚合物的堵塞且有利于Methylocystis的生长。DAS等[42]以含铁炉渣制成的硅酸盐肥料施用于粳稻和籼稻，发现CH4排放量分别降低了21.1%和25.7%，并且与水稻土壤铁还原量的增加相一致。ACHTNICH等[43]研究表明，有Fe(Ⅲ)存在的条件会降低31%~65%的甲烷产生量，由此说明铁元素能参与到甲烷的生物氧化过程中增加甲烷氧化菌对CH4的氧化效率。根据以上实验结果表明，甲烷氧化菌在富铁环境中与甲烷反应时能够分泌色氨酸、腐殖质等胞外产物将胞内电子传递到胞外使得Fe(Ⅲ)作为电子受体，从而增加了甲烷的氧化效率。
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1)牟尼沟草海湿地存在富铁环境。变形菌门中的Type Ⅰ型甲基杆菌对草海湿地中甲烷减排有较高的贡献度。pH和ORP是影响甲烷氧化菌群落组成和多样性的关键环境驱动因素，铁呼吸与草海湿地甲烷循环机制密切相关。
2)缺氧条件下甲基杆菌C1能够以Fe(Ⅲ)作为电子受体支撑对于甲烷的氧化。氧化甲烷的过程中菌株C1会分泌腐殖质等物质将胞内电子转移到胞外，使溶液中的Fe(Ⅲ)作为电子受体。
3)菌株C1以Fe(Ⅲ)作为电子受体时能增加对甲烷的氧化效率。在富铁溶液中反应5 d后氧化效率比未添加Fe(Ⅲ)提高了10.8%，且7 d内能够完全氧化瓶内的甲烷气体。
富铁环境中甲烷氧化菌群落结构与甲烷氧化特性
Community structure and methane oxidation characteristics of methanotrophs in iron-rich environment
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摘要: 近年来湿地潜在甲烷排放备受关注，牟尼沟草海富铁湿地具有十分重要的生态地位，而目前有关该区域甲烷氧化菌群落结构与氧化特性的研究相对较少。通过第二代高通量测序技术探究了草海富铁湿地中甲烷氧化菌的群落结构及功能并从中筛选出一株优势甲烷氧化菌在富铁溶液中进行实验探究。测序结果表明，优势甲烷氧化菌为Type Ⅰ型的甲基杆菌(Methylobacter)和甲基单胞菌(Methylomonas)，RDA分析结果表明，pH和ORP是影响甲烷氧化菌群落的关键环境驱动因素。结果表明，反应过程中菌株会分泌腐殖质等产物将胞内电子转移到胞外，使溶液中的Fe(Ⅲ)作为电子受体。并且在富铁溶液中甲烷氧化效率提高了10.8%左右，7 d内菌株能够完全氧化瓶内的甲烷气体。以上结果以期为湿地甲烷减排提供理论参考依据。Abstract: In recent years, the potential methane emission from wetlands has attracted much attention. The iron-rich wetland in Caohai of Munigou has a very important ecological status. However, there are relatively few studies on the community structure and oxidation properties of methanotrophs in this area. The next generation sequencing technology was used to study the community structure and function of methanotrophs in the iron-rich wetland of Caohai, and a type of dominant methanotrophs was screened out to conduct experiment tests in the iron-rich solution. Sequencing results showed that the dominant methanotrophs were Type I Methylobacter and Methylomonas, and RDA analysis indicated that pH and ORP were the key environmental drivers affecting the methanotrophs community. The experimental results showed that during the reaction, the strain could secrete products like humus to transfer intracellular electrons to extracellular ones. Therefore, Fe (Ⅲ) in the solution could act as an electron acceptor. The oxidation efficiency of methane in the iron-rich solution increased by about 10.8%, and the strain could completely oxidize the methane gas in the flask within 7 days. These results are expected to provide a theoretical reference for methane emission reduction in wetlands.
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Key words:
- iron-rich wetland /
- methanotrophs /
- community structure /
- methane oxidation
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图 4 草海微生物群落C 循环、N 循环、S 循环、人类疾病和铁呼吸功能的相对丰度
Figure 4. Relative abundance of C cycle, N cycle, S cycle, human pathogens and iron respiration function of microbial community in Caohai
图 5 草海微生物群落前10优势功能预测分析
Figure 5. Prediction of the top 10 dominant functions of microbial community in Caohai
图 7 菌株C1对溶液中Fe(III)的还原效果
Figure 7. The reduction effect of strain C1 on Fe (III) in solution
图 8 不同反应时间后溶液中EPS的变化情况
Figure 8. The variation of EPS in the solution at different reaction times
图 10 不同实验条件对甲烷的氧化效率
Figure 10. Oxidation efficiency of methane under different experimental conditions
表 1 草海湿地上覆水及沉积物的理化性质
Table 1. Physical and chemical properties of overlying water and sediments in Caohai wetland
名称 上覆水 沉积物 pH ORP/
mVNO3−/
(mg·L−1)SO42−/
(mg·L−1)TN/
(mg·L−1)TP/
(mg·L−1)TOC/
(mg·g−1)Fe/
(mg·g−1)Mn/
(mg·g−1)CH1-1 7.86 165.4 1.394 4.422 1.851 0.505 177.9 166.947 1.332 CH1-2 7.86 170.7 1.385 4.157 1.839 0.505 182.6 169.350 1.358 CH1-3 7.89 164.7 1.351 4.319 1.891 0.649 198.7 163.379 1.626 CH2-1 7.57 176.3 1.377 6.883 1.927 1.083 155.8 157.106 0.977 CH2-2 7.58 178.3 1.336 6.557 1.950 0.794 148.6 155.136 0.913 CH2-3 7.85 170.7 1.348 6.799 1.887 1.083 153.6 155.473 0.881 CH3-1 7.82 167.9 1.425 7.043 1.945 0.733 166.6 186.450 0.891 CH3-2 7.85 169.0 1.411 6.886 1.915 0.777 183.7 180.468 0.899 CH3-3 7.85 171.7 1.409 7.079 1.952 0.794 173.9 170.401 0.810 
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