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六六六，学名六氯环己烷 (Hexachlorocyclohexane, HCH) ，是典型有机氯农药，在我国的产量占全世界生产总量的33%[1-2]。HCH作为持久性有机污染物 (persistent organic pollutants，POPs) 可通过多种环境介质传播，危害人类健康。目前，我国存在环境中HCH残留量过高的问题，特别是曾经作为农药大量使用的林丹 (γ-HCH) ，在农田、湖泊等环境中存在残留[3-5]。因此，亟需探索HCH在环境中的迁移转化过程的有效解析方法，以制定污染防治策略。
林丹在环境介质中的浓度可能受到吸附、挥发等物理过程的影响，单一的检测数据易造成污染物减少的假象，并不能准确地反映其在环境中的迁移转化过程[6-8]。单体稳定同位素分析技术 (compound-specific isotope analysis，CSIA) 能避免因产物浓度变化和复杂实地环境产生的干扰，弥补传统测试方法的不足，近年来在环境领域的应用中发展较快[9-10]。在有机物降解过程中，一般含轻同位素12C化学键的断键速度快于含重同位素13C的化学键，从而导致底物中13C的富集[11]。重同位素的丰度与轻同位素的丰度值之比为同位素比值。CSIA技术可通过测定并对照反应前后污染物中某元素的同位素比值变化来追踪污染物的来源并解析其在环境中的迁移转化过程[12]，为解析有机污染物在环境中的迁移转化过程提供了新思路[9, 13]。
好氧微生物降解是HCH在环境中转化的重要途径。目前，有多达30多种好氧微生物被证实具有降解HCH的能力[14]。然而，这类微生物在降解HCH过程中的同位素分馏特性不明，极大限制了应用稳定同位素技术解析HCH在环境中的迁移转化行为。BASHIR等[15]利用碳同位素分馏特性表征了Sphingobium indicum strain B90A 和Sphingobium japonicum strain UT26对α-HCH和γ-HCH的降解过程，并计算了同位素富集系数ε值。这两种微生物降解α-HCH过程中的ε值分别为−(1.0±0.2) ‰和−(1.6±0.3) ‰，降解γ-HCH过程中的ε值分别为−(1.5±0.1) ‰和−(1.7±0.2) ‰。
基于已经报道的ε值，用式 (1) 计算了地下水中HCH的降解程度 (B%) ，与实测结果进行对照，发现部分采样点的计算结果与实际测试值并不相符[10, 16]。
式 (1) 表明，污染物降解程度评估的准确性取决于ε值，然而，已见报道的ε值还很有限，限制了技术在解析环境中林丹降解程度以及污染场地修复效果评估中的应用。此外，实际环境中林丹的降解可能由多个微生物共同参与完成，而同一污染场地中不同微生物降解林丹过程中的同位素分馏特性是否相同亦为制约CSIA技术应用的关键，故尚需开展进一步研究。
以3种从同一污染场地分离纯化获取的好氧微生物S. quisquiliarum P25、S. ummariense RL-3和Sphingobium sp. F2为研究对象[17-19]，对比分析其降解林丹过程中的降解动力学特性、单体稳定同位素分馏效应、二维稳定同位素分馏及表观动力学同位素特性。拟揭示不同好氧微生物在降解HCH过程中的同位素分馏特性，并基于二维同位素分析，解析不同微生物降解林丹过程中同位素分馏特性的差异。以期为建立模型解析实际环境中HCH的迁移转化过程提供重要参考值，为应用CSIA评估林丹污染场地修复效果的实际应用提供数据基础。
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实验所用林丹 (γ-HCH，分析纯) 、六氯苯 (HCB，分析纯) 、正己烷 (分析纯) ，均由Sigma-Aldrich公司提供。
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1) 降解实验：将S. quisquiliarum P25、S. ummariense RL-3和Sphingobium sp. F2在LB培养基中进行预培养。当A600达到0.5~0.6时，取100 µL菌液 (基于前期预实验结果确定) 到50 mL无机盐培养基中 (120 mL血清瓶) ，每瓶添加5.5 µLγ-HCH储备液 (0.1 mol·L−1) 并添加葡萄糖作为碳源，开展序批实验。每组实验设置15个平行培养体系，其中包括2个非生物对照组，在微生物最适温度30 ℃下进行恒温培养。在达到不同降解程度时 (基于前期预实验结果确定) 分别向培养瓶中添加l mL硫酸和硫酸钠混合饱和溶液 (pH=2) 以终止反应。将终止反应后的培养瓶置于4 ℃的冰箱内冷藏保存，至实验结束后统一萃取HCH。
2) 萃取实验：以正己烷为萃取液，HCB为内标，通过液液萃取提取HCH。内标浓度约为HCH初始浓度的一半 (2.5 µmol·L−1) 。具体方法详见文献[8]。
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1) 浓度测试：HCH的浓度采用气相色谱 (GC，安捷伦6890) 连接火焰离子化检测器 (FID，安捷伦7820A，美国) 由安捷伦HP-5毛细管柱 (30 m×0.32 mm ID×0.25 µm FD) 测定，载气流速为2.0 mL·min−1。升温程序设置为初始温度35 ℃保持5 min, 然后以8 ℃·min−1的升温速率升至180 ℃，接着以2 ℃·min−1的速度升高至195 ℃，最后以8 ℃·min−1的速度升高至220 ℃并保持2 min[8]。在建立计算曲线的基础上计算HCH浓度。
2) 稳定同位素测试：碳稳定同位素值 (δt13C) 采用GC (安捷伦6890) 连接同位素质谱仪 (IRMS, 赛默飞MAT253) 测定，色谱柱为ZB1 (60 m×0.32 mm×1 µm，Phenomenex) ，载气流速为2.0 mL·min−1。升温程序设置为40 ℃的初始温度保持5 min, 然后以6 ℃·min−1的速度升高至200 ℃，再以3 ℃·min−1的速度升温至260 ℃，最后以20 ℃·min−1的速度升高至300 ℃并保持5 min [7]。氯稳定同位素值 (δt37Cl) 采用GC耦合多集电极电感耦合等离子体质谱仪 (GC-MC-ICPMS) 测定，GC (安捷伦6890) 所用色谱柱及参数设置与碳同位素设置一致[20-22]。
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1) 酶促反应动力学。用Michaelis−Menten动力学方程[23]来表征酶促反应，计算式如式 (2) 。
式中：v为反应速率，mol∙L−1∙s−1；kcat为催化常数，s−1；KM为米氏常数；[E]0为酶的初始浓度。
2) 同位素分馏的定量分析。γ-HCH降解过程中的碳同位素值变化的快慢可以通过碳同位素分馏系数 (εC) 来定量，εC利用瑞利方程计算，如式 (3) 所示。
式中：
$ {\varepsilon }_{\mathrm{C}} $ 基于ln(Ct/C0) vs ln[(δ13Ct+1)/( δ13C0+1)]的斜率获得；其误差范围在线性回归95%的置信区间。3) 二维同位素定量分析。通过同位素分馏实验获取的δ13C和δ37Cl，计算二维同位素分馏系数 (Λ) 来表征C—Cl的断键机理，表观动力学同位素分馏常数(apparent kinetic isotope effect，AKIE)，计算如式 (4) 。
表观动力学同位素分馏常数 (AKIE) 可在考虑物质结构的基础上表征不同物质降解过程中同位素变化的速度，从而实现不同物质在相同降解作用下的对比分析。AKIE根据式 (5) 计算[24]。
式中：n为底物分子中所有碳原子数量；x为反应点位上的碳原子数量；z为不可区分的反应点位数量。
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微生物降解反应的核心是酶促反应，这些酶均由跟HCH降解酶相关的基因 (lin 基因) 表达而来，如LinA、LinB、LinC等[25]。当底物浓度远远小于Michaelis常数，即[S]
$ \ll $ KM时，Michaelis−Menten动力学方程可以简化为式 (6) 。式中：
$ k=-\dfrac{{k}_{\mathrm{c}\mathrm{a}\mathrm{t}}\times {\left[E\right]}_{0}}{{K}_{\mathrm{M}}} $ 为一级反应动力学常数，由动力学模型计算得出。因此，当[S]
$ \ll $ KM时，酶促反应符合一级反应动力学模型。前期实验证实，当HCH浓度低于25 µmol· L−1时，满足[S]$ \ll $ KM的条件，且γ-HCH降解酶的反应符合一级反应动力学模型[26]。在本研究中，γ-HCH初始浓度为5.5 µmol·L−1，低于实验中初始浓度的1/4，故本研究实验条件满足[S]$ \ll $ KM，则所涉及的酶促反应符合一级反应动力学模型。 -
如图1所示，Sphingobium sp. F2，S. ummariense RL-3和S. quisquiliarum P25均可降解γ-HCH。空白对照组γ-HCH浓度稳定，可排除非生物降解对污染物浓度的影响。在对HCH持续降解25 h后，Sphingobium sp. F2组中γ-HCH从5.5 µmol·L−1降至0.8 µmol·L−1，降解率达到86%，降解速率为0.08 h−1；S. ummariense RL-3组在培养10 h后，降解率达到97%，降解速率为0.36 h−1；而S. quisquiliarum P25组5 h内降解率达到94%，降解速率为0.52 h−1。在相同培养条件下3种微生物降解γ-HCH速率差异较大，原因是微生物降解HCH的关键酶是水解脱氢酶的变异体[17-19]，3种微生物的不同的水解脱氢酶对γ-HCH的降解速率有较大影响。BASHIR等 [15]也报道过Sphingobium indicum strain B90A 和 Sphingobium japonicum strain UT26在同等条件下降解γ-HCH的降解速率不同。
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如图2 (a) 所示，3组实验γ-HCH降解过程中均发生了明显的碳稳定同位素分馏现象。其中，在Sphingobium sp. F2的降解过程中，当γ-HCH降解率达到86%时，δ13C由−(27.2±0.2) ‰富集为−(16.5±0.3) ‰；在S. ummariense RL-3的降解过程中，当γ-HCH降解率达到97%时，δ13C由−(27.2±0.2) ‰富集为−(21.7±0.4) ‰；当S. quisquiliarum P25降解γ-HCH达到94%时，δ13C由−(27.2±0.2) ‰富集为−(15.7±0.3) ‰。3组降解实验中δ13C的富集差值 (△δ13C=δ13Ct-δ13C0) 分别达到了 (10.7±0.49) ‰(γ-HCH降解速率为0.08 h−1，降解率为86%)、 (5.5±3.24) ‰ (γ-HCH降解速率为0.36 h−1，降解率为97%) 、 (11.5±0.73) ‰ (γ-HCH降解速率为0.52 h−1，降解率为94%) 。对于同一物质的同一降解反应，降解率越高，同位素富集效应越明显。值得注意的是，Sphingobium sp. F2的降解率只有86%，而△δ13C值却明显比降解率更高 (97%) 的S. ummariense RL-3的更大。这表明Sphingobium sp. F2 和S. ummariense RL-3降解γ-HCH过程中有明显不同的同位素分馏特性。同时，S. ummariense RL-3和S. quisquiliarum P25降解率相近，但△δ13C值差别同样较为明显。因此，根据降解率和碳稳定同位素分馏效应分析，这3种菌降解γ-HCH的过程存在明显差异。这一结果与BASHIR等[15]研究Sphingobium indicum strain B90A和Sphingobium japonicum strain UT26降解γ-HCH过程所产生的同位素分馏效应的结果类似。
如图2 (b) 所示，3种微生物在降解γ-HCH过程中，氯稳定同位素分馏也较为明显。在Sphingobium sp. F2降解γ-HCH过程中，当降解率为65%时，底物中γ-HCH的δ37Cl值为 (3±0.2) ‰；在S. ummariense RL-3的降解过程中，当降解率达到75%时，底物中γ-HCH的δ37Cl值为 (3.2±0.1) ‰；在S. quisquiliarum P25的降解γ-HCH达到82%时，γ-HCH的δ37Cl值为 (3.7±0.1) ‰。氯元素的稳定同位素分馏相对于碳稳定同位素分馏较小，故3种微生物在降解γ-HCH过程中氯稳定同位素分馏的差异也较小。
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为消除降解率不同的干扰，进行了基于瑞利方程的同位素富集过程的定量分析。如图3 (a) 所示，Sphingobium sp. F2，S. ummariense RL-3和S. quisquiliarum P25在降解γ-HCH过程中的εC分别为−(5.7±0.5) ‰，−(1.6±0.1) ‰和−(4.3±0.4) ‰。协方差分析结果显示，这3组εC值具有显著性差异 (p<0.005) ，且任意两组εC值之间同样具有显著性差异。与△δ13C值的排序对比可知，εC值的计算有效的排除了降解率的干扰，更准确的反应了γ-HCH降解过程中的同位素分馏特性。基于同位素分馏形成的机制，由于遮蔽效应的存在，过高的降解速率可能会降低同位素富集效果[7]。在本实验中，S. ummariense RL-3降解γ-HCH的速率 (0.36 h−1) 比S. quisquiliarum P25的降解速率 (0.52 h−1) 低，但后者的εC值明显高于前者，故同位素遮蔽效应不是导致同位素分馏系数差异的原因。导致εC不同的原因是不同微生物酶降解γ-HCH时的同位素分馏特性不同。这与BASHIR等[15]对Sphingobium indicum strain B90A和Sphingobium japonicum strain UT26在相同培养条件下降解γ-HCH过程中的同位素分馏系数类似的结果存在一定差异。此外，与报道的土壤实验结果对比发现，在土壤环境中S. quisquiliarum P25降解γ-HCH所产生的εC值 (−3.2‰) [27]，较本实验结果εC值偏低。这是由于土壤相对于液体环境来说是非均质环境，HCH在非均质环境中不均匀的分散是导致局部降解过程中出现同位素遮蔽效应的主要原因。
如图3 (b) 所示，Sphingobium sp. F2，S. ummariense RL-3和S. quisquiliarum P25在降解γ-HCH过程中均发生明显的氯同位素分馏，经瑞利方程拟合得到的εCl值分别为− (1.1±0.6) ‰，− (1.5±0.2) ‰和− (1.5±0.4) ‰。基于协方差分析结果，Sphingobium sp. F2的εCl值与其他2组具有显著性差异 (p<0.05) ；S. ummariense RL-3和S. quisquiliarum P25的εCl值不具有显著性差异 (p>0.05) ，这与3组实验碳同位素分馏过程中的εC值都具有显著性差异的结果不同，表明单一元素的同位素分馏对断键过程的表征具有一定的局限性。有报道显示纯化后的水解脱氢酶LinA1和LinA2降解γ-HCH过程中εCl值分别为− (2.7±0.3) ‰和− (2.5±0.4) ‰，明显高于微生物降解过程中的εCl值，这与跨膜传质过程可能会导致同位素分馏遮蔽效应的结论一致[7]。
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如图4所示，Sphingobium sp. F2，S. ummariense RL-3和S. quisquiliarum P25在降解γ-HCH过程中的碳/氯二维同位素分馏系数 (ΛC-Cl) 分别为 (3.0±0.3) ， (1.1±0.1) 和 (2.7±0.2) 。基于协方差分析结果，S. ummariense RL-3与其他2种微生物的ΛC-Cl值具有显著性差异 (p＜0.05) ，然而Sphingobium sp. F2和S. quisquiliarum P25的ΛC-Cl值不具有显著性差异 (p>0.05) 。由于传质过程对反应点位的C和H的影响是同步的，因此二维同位素可以有效消除传质过程中同位素的遮蔽效应[21]。基于二维同位素分析结果，认定Sphingobium sp. F2和S. quisquiliarum P25在降解γ-HCH过程中具有相同的降解机理，且与S. ummariense RL-3的降解机理不同。这可能是由于Sphingobium sp. F2和S. quisquiliarum P25与S. ummariense RL-3的lin基因表达了不同的HCH降解酶。例如，前者是LinB酶，而后者是LinA酶等。LIU等[28]的研究结果为纯化后得水解脱氢酶LinA1和LinA2降解γ-HCH过程中的ΛC-Cl值分别为 (2.7±0.2) 和 (2.9±0.2) ，与本研究中Sphingobium sp. F2和S. quisquiliarum P25的值一致，无显著性差异 (p>0.05) 。这一结果与分析微生物降解与纯酶降解单一同位素富集系数存在差异的结果形成对照，进一步表明二维同位素分析可消除同位素分馏的遮蔽效应，并表征污染物的断键机理。
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HCH的降解是一个脱氯化氢的过程，利用公式 (5) 分别计算了3种微生物降解γ-HCH过程中的AKIEC值。由于在HCH的6个C—Cl键中，处于轴向的C—Cl键比处于横向的C—Cl键更容易断键，因此，γ-HCH处于轴向的3个C—Cl键都是可能的反应点位，而不可区分的反应点位有2个。在计算AKIEC的时候，总碳原子数、反应点位数和不可区分反应点位数分别为n=6，x=3，z=2。经计算，Sphingobium sp. F2，S. ummariense RL-3和S. quisquiliarum P25降解实验中的AKIEC值分别为 (1.023±0.002) ， (1.006±0.001) 和 (1.018±0.002) 。3种菌降解γ-HCH所获得的AKIEC值均低于Streitwieser-半经典极限中C—Cl断键产生的AKIEC值1.057[24]。SCHILLING等[26]的研究中水解脱氢酶LinA酶降解γ-HCH过程中获得的AKIEC值分别为 (1.024±0.001) 和 (1.023±0.001) 。文献[15]的结果表明，Sphingobium indicum strain B90A和Sphingobium japonicum strain UT26降解α-HCH过程中所产生的AKIEC值分别为 (1.003±0.001) 和 (1.005±0.001) ，均与Sphingobium sp. F2降解γ-HCH所获得的AKIEC值 (1.023±0.002) 接近。AKIEC的计算中已考虑物质结构差异的影响，故不同物质相似的AKIEC表明反应机理一致。此外，不同的微生物在降解不同物质过程中可能产生类似的同位素分馏效应。如Sphingobium japonicum strain UT26和S. ummariense RL-3在分别降解α-HCH和γ-HCH过程中碳同位素分馏特性类似。这表明这2种微生物在脱氯化氢过程中机理相同。有报道称Sphingobium japonicum strain UT26的lin基因所表达的HCH降解酶为LinA酶[25]，故推断S. ummariense RL-3的lin基因所表达的酶为LinA酶。
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本研究中所涉及的3种微生物降解林丹的过程均符合一级反应动力学，并且降解过程中林丹均发生了明显的碳/氯同位素分馏效应。基于组内对照及前期研究对比，不同好氧微生物降解林丹过程中同位素分馏效应差异较大。Sphingobium quisquiliarum P25、Sphingobium ummariense RL-3和Sphingobium sp. F2降解林丹过程中εC值分别为−(4.3±0.4) ‰，−(1.6±0.1) ‰和−(5.7±0.5) ‰；εCl值分别为−(1.1±0.6) ‰，−(1.5±0.2) ‰和−(1.5±0.4) ‰；ΛC-Cl值分别为 (3.0±0.3) ， (1.1±0.1) 和 (2.7±0.2) ；AKIEC值分别为： (1.023±0.002) ， (1.006±0.001) 和 (1.018±0.002) 。基于二维同位素分析和AKIEC分析，这种同位素分馏效应的差异是由不同微生物的HCH降解酶不同引起的，并推测S. ummariense RL-3的lin基因所表达的酶为LinA酶。以上结论可为应用CSIA技术解析林丹在自然条件下的迁移转化过程，以及分析在微生物修复过程中不同微生物的贡献提供数据支撑。
好氧微生物降解林丹过程中碳-氯二维稳定同位素的分馏特性
Fractionation characteristics of two-dimensional stable isotopes of carbon-chlorine in the process of Lindane degradation by aerobic microorganisms
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摘要: 六氯环己烷 (HCH) 是一种持久性污染物，环境存量较大时会造成污染，定量研究其在环境中的迁移转化过程具有重要意义。研究了3种好氧微生物Sphingobium quisquiliarum P25、Sphingobium ummariense RL-3和Sphingobium sp. F2降解γ-HCH (林丹) 的过程，应用单体稳定同位素分析技术 (CSIA) 探究了不同微生物对HCH的降解效果，及其对HCH转化与迁移行为的影响。结果表明：1) 3种微生物降解γ-HCH的过程符合一级反应动力学原理；2) 降解过程中碳分馏系数 (εC) 分别为−(4.3±0.4)‰，−(1.6±0.1) ‰和−(5.7±0.5) ‰，氯同位素分馏系数 (εCl) 分别为−(1.1±0.6) ‰，−(1.5±0.2) ‰和−(1.5±0.4)‰；3) 二维同位素分馏系数 (ΛC-Cl) 分别为(3.0±0.3)，(1.1±0.1)和(2.7±0.2)。本研究结果可为应用单体稳定同位素分析技术解析复杂环境中HCH的迁移转化过程并评估HCH污染场地修复效果提供参考。
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关键词:
- 同位素分馏 /
- 好氧微生物 /
- 六氯环己烷(六六六) /
- 单体稳定同位素分析技术(CSIA)
Abstract: Hexachlorocyclohexane (HCH) is a persistent pollutant that causes pollution in large quantities in the environment, it is very important to quantitatively study its migration and transformation process in the environment. The degradation process of γ-HCH (Lindan) by three aerobic microorganisms, Sphingobium quisquiliarum P25, Sphingobium ummariense RL-3 and Sphingobium sp. F2 were studied. Monomer stable isotope analysis (CSIA) was used to investigate the degradation of HCH by different microorganisms and their effects on the transformation and migration of HCH. The results showed that the degradation of γ-HCH by three kinds of microorganisms was consistent with the principle of first-order reaction kinetics. Carbon fractionation coefficient (εC) was −(4.3±0.4)‰, −(1.6±0.1)‰ and −(5.7±0.5)‰, respectively. Chlorine isotope fractionation coefficient (εCl) was − (1.1±0.6) ‰, − (1.5±0.2) ‰, and −(1.5±0.4)‰, respectively. Two-dimensional isotope fractionation coefficients (ΛC-Cl) was (3.0±0.3), (1.1±0.1) and (2.7±0.2), respectively, The results of this study can provide a reference for the application of monomer stable isotope analysis technology to analyze the migration and transformation process of HCH in complex environments and evaluate the restoration effect of HCH contaminated sites. -
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图 2 γ-HCH降解过程中的稳定同位素分馏
Figure 2. Stable isotope fractionation during γ-HCH degradation
图 3 基于瑞利方程的碳和氯同位素分馏特性分析
Figure 3. Analysis of carbon and chlorine isotope fractionation based on Rayleigh equation
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