本实验在济南大学水利与环境学院温室中进行，温度保持在(25±3) ℃，模拟构建了2个CW-MFC装置模型。如图1所示，闭路运行的CW-MFC1与开路运行的CW-MFC2的圆柱型池体由有机玻璃制成，内径20 cm，高50 cm。由下向上依次填充底层基质粗砾石5 cm，细砾石10 cm、阳极层基质生物炭10 cm、中间层基质沸石15 cm、阴极层基质生物炭5 cm。在阳极层中部与阴极层顶部铺设附着在不锈钢网上的碳纤维毡以增强电子的转移。在空气阴极层种植4颗菖蒲。其中CW-MFC1阴极与阳极之间使用绝缘铜线相连接，中间连接1 000 Ω电阻形成闭合回路。CW-MFC2阴极与阳极之间不进行连接，开路模式运行，本质上是传统人工湿地。使用黑色遮光布对装置与水箱进行遮光处理防止藻类的产生和抗生素的光解。

受试废水是人工制备的合成废水，由160 mg·L⁻¹葡萄糖、160 mg·L⁻¹乙酸钠、89 mg·L⁻¹ NH₄Cl、16 mg·L⁻¹ KNO₃、10 mg·L⁻¹ KH₂PO₄、10 mg·L⁻¹ CaCl₂和5 mg·L⁻¹ MgSO₄组成。在实验装置构建完成后，使用活性污泥对阳极进行接种，活性污泥取自济南光大水务二厂；之后进入培养期，合成废水使用蠕动泵从底部进水口连续泵入2个实验装置，流量为1.190 mL·min⁻¹，2个实验装置的水力停留时间(hydraulic retention time, HRT)为3 d。在30 d后，装置内形成稳定的生物膜，出水水质稳定，CW-MFC1输出端电压稳定。系统达到稳定后，在合成废水中加入目标抗生素磺胺甲恶唑(SMX)与盐酸环丙沙星(CIPH)各2 mg·L⁻¹，该系统运行90 d。

1)常规水质指标的测定。每3 d从装置顶部出水口采集系统出水，同时获取进水样品。在水样采集当天，分别按照以下标准方法测定出水水质指标。$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $-N采用靛酚蓝比色法测定，$ {\rm{N}}{{\rm{O}}^ -_3} $-N采用紫外分光光度法测定，TN采用碱性过硫酸钾消解-紫外分光光度法(HJ 636-2012)测定，COD采用快速消解分光光度法(HJ/T 399-2007)测定。所有的目标污染物检测均设定3个重复。

2)抗生素检测方法。每6 d从装置顶部出水口采集系统出水，检测抗生素(CIPH和SMX)的浓度。进出水样品使用0.22 μm滤膜过滤后采用高效液相色谱和紫外检测器(DAD)测定SMX和CIPH的质量浓度。采用C18反相柱(4.6 mm×250 mm；5 μm)，2种抗生素的注射量均为20 μL，流动相流速为1 mL·min⁻¹。CIPH流动相为0.025 mol·L⁻¹磷酸∶乙腈=75∶25，用三乙胺溶液调节磷酸溶液pH至(3.0±0.1)，荧光检测波长为278 nm。SMX流动相为水∶乙腈=1∶1，荧光检测波长为272 nm。

3)微生物群落分析。装置运行结束后，采集装置阳极层(A)与阴极层(C)基质，探究开路和闭路运行模式下阴极与阳极微生物群落多样性和组成。采集的基质送到杭州LC-Bio科技有限公司。使用E.Z.N.A.®Soil DNA Kit土壤试剂盒进行DNA的提取。针对16SrRNA基因V3~V4高变区，选择正向引物341F(5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3')和反向引物805R(5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3')作为扩增引物。在Illumina Novaseq平台上按照制造商的操作指南进行测序。使用Vsearch (2.3.4版本)筛选高质量的嵌合序列，利用DADA2进行解调，得到特征表和特征序列。通过QIIME2软件获取观测物种、Chao1、Shannon和Simpson指数。

采用Excel 2019进行数据的平均值和标准偏差计算，采用SPSS 26进行统计差异与相关性分析，使用Origin 2018软件绘制图形，使用Canoco 5进行冗余分析(RDA)。

表1所示为CW-MFC1(闭路)和CW-MFC2(开路)运行期间的进出水污染物平均质量浓度与平均去除率。CW-MFC1和CW-MFC2对$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $-N、TN和COD的平均去除率为75.86%和69.79%、71.96%和64.51%、93.25%和86.38%，CW-MFC1比CW-MFC2分别高出6.07%、7.45%和6.87%。在闭路运行模式下，CW-MFC的$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $-N、TN和COD平均去除率显著高于开路运行模式下的CW-MFC (P<0.05)。CW-MFC1和CW-MFC2的对$ {\rm{N}}{{\rm{O}}^ -_3} $-N的去除率分别为55.22%和63.54%，出水质量浓度为(1.06±0.11) mg·L⁻¹和(0.87±0.10) mg·L⁻¹，闭路运行的CW-MFC相比开路运行的CW-MFC，对$ {\rm{N}}{{\rm{O}}^ -_3} $-N去除率低8.32%，但出水质量浓度相差不大。上述结果表明，虽然闭路运行与开路运行的CW-MFC对氮与COD都有较好的去除率，但与开路运行的CW-MFC相比，闭路运行的CW-MFC表现出更好的去除性能，表明采用闭路运行模式在人工湿地中形成完整的微生物燃料电池系统，可以增强废水中氮与COD的去除。

有研究表明，闭路运行模式可以加快电化学细菌在电极上的富集与生长^[17]，而电化学活性细菌对CW-MFC中硝化和反硝化过程会有促进作用^[18]。在本研究中，闭路运行的CW-MFC中电化学细菌和氨氧化细菌具有更高的丰度，可使硝化作用得到增强，这可能是其中$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $-N去除率较高的主要原因。此外，较高的微生物活性同样是COD去除率高的原因。TEOH等^[19]对上升流CW-MFC中硝酸盐去除的沿程变化进行研究时发现，废水中的$ {\rm{N}}{{\rm{O}}^ -_3} $-N进入装置底部厌氧区后得到有效去除，但在阴极层出水中又有所增加，这与硝化作用产生$ {\rm{N}}{{\rm{O}}^ -_3} $时$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $的减少相对应。由此可推测，本研究进水中$ {\rm{N}}{{\rm{O}}^ -_3} $-N在进入装置底部后经过反硝化作用得到有效去除。但污水经过阴极区时，在有氧条件下经过硝化作用将$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $-N转化为$ {\rm{N}}{{\rm{O}}^ -_3} $-N，一部分扩散进入厌氧区域通过反硝化作用去除；另一部分未得到及时去除而随着出水流出。因此，出水中$ {\rm{N}}{{\rm{O}}^ -_3} $-N质量浓度又有增加。而本研究合成废水中氮主要以$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $-N存在，由于形成完整的微生物燃料电池通路，闭路运行的CW-MFC中$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $-N去除效率较高，硝化作用可产生更多$ {\rm{N}}{{\rm{O}}^ -_3} $-N，这可能是导致其$ {\rm{N}}{{\rm{O}}^ -_3} $-N出水质量浓度高于开路运行下CW-MFC的主要原因。此外，本研究进水总氮主要以$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $-N存在，因此，较高的$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $-N去除率导致较高的总氮去除率，这与出水总氮含量的测试结果相互吻合。

运行期间开闭路2种运行模式下CW-MFC出水中$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $-N、$ {\rm{N}}{{\rm{O}}^ -_3} $-N、TN和COD的动态变化情况如图2所示。结果表明，开始加入抗生素后，CW-MFC1与CW-MFC2 系统中出水$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $-N、TN和COD的质量浓度值变化趋势为先升高后降低最后趋于稳定，$ {\rm{N}}{{\rm{O}}^ -_3} $-N质量浓度为先降低后升高但十分不稳定。加入抗生素后，开路运行模式和闭路运行模式下CW-MFC出水$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $-N质量浓度均有所升高，在第15天左右最高可增加到7.44 mg·L⁻¹和9.25 mg·L⁻¹。有研究表明，高浓度的抗生素会抑制微生物活性，改变细菌群落结构，降低微生物多样性^[20-21]，特别是一些参与硝化与反硝化的细菌对抗生素具有很高的敏感性^[22]。在CW-MFC系统中，氮的去除主要由微生物脱氮完成，加入抗生素后，系统的微生物群落结构遭到破坏，硝化反硝化能力会降低。因此，抗生素加入的初期，$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $-N去除率降低，出水质量浓度也随之升高，之后随着运行时间的增加，出水质量浓度逐渐降低，直到系统运行45 d之后出水质量浓度开始趋于稳定。这是因为，随着系统运行时间的增加，在抗生素的环境压力诱导下，抗生素抗性基因逐渐产生，抗生素耐药性细菌出现，抗生素对微生物的抑制作用变小，微生物群落稳定性逐渐增强，因此，$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $-N去除率逐渐升高，出水质量浓度逐渐降低。$ {\rm{N}}{{\rm{O}}^ -_3} $-N变化趋势总体与$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $-N相反，但出水质量浓度变化较大。原因可能是：由于抗生素的加入，由$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $-N转化的$ {\rm{N}}{{\rm{O}}^ -_3} $-N减少，但抗生素同样对反硝化细菌有影响，从而降低$ {\rm{N}}{{\rm{O}}^ -_3} $-N的去除效果。同上，由于本研究总氮主要以$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $-N存在，出水总氮质量浓度的变化大体与$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $-N变化趋势相同。抗生素的出现对微生物群落结构产生影响，随着微生物多样性的减少及其丰度的降低，耗氧有机物(以COD计)消耗随之减少，出水COD值增加，之后系统逐渐稳定，出水COD值降低。在加入抗生素之前，2个装置已形成稳定生物膜，闭路运行模式的CW-MFC具有更好的污染物去除性能和微生物活性，因而即使系统微生物群落受到抗生素的冲击，但闭路运行的CW-MFC比开路运行的CW-MFC具有更好的抵抗力，闭路运行的CW-MFC仍保持更好的处理性能。

图3为运行期间开闭路2种运行模式下CW-MFC出水中目标抗生素质量浓度的变化。CW-MFC1和CW-MFC2中CIPH的平均出水质量浓度分别为4.23 μg·L⁻¹与7.73 μg·L⁻¹，平均去除率为99.79%与99.61%，SMX的平均出水质量浓度分别为22.43 μg·L⁻¹与34.96 μg·L⁻¹，平均去除率为98.89%和98.25%。上述结果表明，闭路运行的CW-MFC与开路运行的CW-MFC对CIPH和SMX都有较好的去除效果，闭路运行的CW-MFC对CIPH和SMX的出水质量浓度显著低于开路运行的CW-MFC(P<0.05)，同时，2个系统中CIPH的去除效果显著好于SMX的去除效果(P<0.05)。

CW-MFC主要通过基质吸附，微生物降解和植物吸收等方式去除废水中的抗生素^[23]。水解与光解也是去除抗生素的途径，CIPH容易发生光解，SMX易发生水解^[24-25]。本研究装置的池体使用黑色遮光布覆盖，以此降低CIPH的光解作用。本研究中，装置内pH保持在7左右，此时水解作用十分有限^[25]。因此，本实验不考虑抗生素的光解与水解作用。在CW-MFC系统中，阳极微生物会分解葡萄糖以及一些难降解有机物产生电子，而闭路运行模式的CW-MFC阳极产生的电子通过外电路到达阴极，为阴极提供了更多的末端电子受体，从而可提高阴极还原速率。因此，闭路运行模式可能具有更高的阳极微生物活性，从而提高了污染物的利用率，可促进抗生素的微生物降解^[26]。同时，YANG等^[27]的研究表明，电吸附过程可以增强基质对抗生素的吸附能力，闭路运行模式的CW-MFC中有弱电流的存在，这可能是其具有更好去除抗生素效率的原因之一。有研究^[28]表明，喹诺酮类抗生素的去除主要靠基质的吸附作用，而磺胺类抗生素的去除则是以微生物作用为主。这可能是2种抗生素出水质量浓度差异较大的原因。LIU等^[29]的研究表明，CW对喹诺酮类抗生素的去除效果要远高于磺胺类抗生素，这与本研究得到的结果一致。

表2为利用Illumina Novaseq测序得到的Alpha多样性数据。闭路运行的CW-MFC阳极微生物的丰富度(Chao1)与多样性(Shannon、Simpson)显著高于开路运行的CW-MFC(P<0.05)。在闭路运行的CW-MFC装置中，阳极微生物的丰富度和多样性显著高于阴极微生物(P<0.05)。而在开路运行的CW-MFC装置中则相反，阳极微生物的丰富度和多样性略微低于阴极微生物。以上结果表明，不同运行模式显著改变了微生物的丰富度和多样性。闭路运行的CW-MFC由于电流刺激促进了微生物在阳极的富集与生长，这与闭路运行模式的CW-MFC对污染物有更好的去除性能相一致。微生物降解是主要的污染物去除途径，因此，更高的微生物丰度会带来更好的处理性能。

图4(a)所示为CW-MFCs中细菌门水平相对丰度最高的20个门。在2个CW-MFC阳极中，变形菌门(Proteobacteria)是主要的优势菌门之一，具有最高的相对丰度，分别为49.71%和48.38%，其次是拟杆菌门(Bacteroidetes)、Patescibacteria、浮霉菌门(Planctomycetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)。在2个CW-MFC阴极中，变形菌门(Proteobacteria)同样是主要的优势菌门，且具有更高的相对丰度，分别为62.56%和64.43%，其次是拟杆菌门(Bacteroidetes)，Patescibacteria，疣微菌门(Verrucomicrobia)和硝化螺旋菌门(Nitrospirae)。这些广泛存在于自然界中的菌门，在污染物的去除方面扮演着重要的角色。Proteobacteria可以有效降解污水中营养物质与一些有机污染物，同时在生物电的生产中起着重要的作用^[30]。在本研究中，闭路运行的CW-MFC阳极和阴极Proteobacteria的相对丰度略高于开路运行的CW-MFC，但差异不显著(P>0.05)，但2个装置阴极Proteobacteria的相对丰度显著大于阳极(P<0.05)。Bacteroidetes与Chloroflexi作产电菌，在2个装置阳极的相对丰度均高于阴极。在2个装置的阳极，闭路运行的CW-MFC中Patescibacteria的相对丰度低于开路运行的CW-MFC，但Planctomycetes的相对丰度高于开路运行的CW-MFC。属于Planctomycetes的厌氧氨氧化细菌类群可以在厌氧环境下，以$ {\rm{N}}{{\rm{O}}^ -_2} $作为电子受体，直接将$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $转化为N₂从而达到脱氮的目的^[31]。因此，闭路运行的CW-MFC阳极Planctomycetes相对丰度较高可能是其$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $-N去除率高的原因之一。在2个装置阴极，闭路运行模式的CW-MFC中Verrucomicrobia和Nitrospirae的相对丰度均高于开路运行模式。Verrucomicrobia中的甲烷营养细菌类群，可以将CH₄转化为CO₂^[32]，而Nitrospirae中的一些硝化细菌，可以将$ {\rm{N}}{{\rm{O}}^ -_2} $氧化成$ {\rm{N}}{{\rm{O}}^ -_3} $。这进一步表明：不同运行模式可以影响CW-MFC系统的微生物群落结构，从而影响系统对氮和抗生素处理性能。

选取相对丰度最高的30个属，将其中未分类的归为一类，得到图4(b)。可以看出，开闭路运行模式对细菌属水平上的结构有明显的影响。在2个装置阳极，主要的菌属为地杆菌属(Geobater)、陶厄氏菌属(Thauera)、甲基娇养杆菌属(Methylotenera)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、脱硫单胞菌属(Desulfuromonas)、Nitrospira、Ellin6067等菌属。Geobater是CW-MFCs装置阳极相对丰度最高的属，这是一种典型的电化学活性细菌，属于产电菌中的优势菌属^[33]。闭路运行模式下CW-MFC的Geobater相对丰度的显著高于开路运行模式，而闭路运行时电子可以通过外电路到达阴极产生电流，二者结果一致。Thauera具有反硝化能力，作为一种反硝化功能菌，其在2个装置阳极的相对丰度为4.00%和3.68%，远大于其在2个装置阴极0.81%和0.48%的相对丰度，由此可知，阳极厌氧区域确实为进行反硝化作用的主要场所。Ellin6067是一种亚硝化菌属，Nitrospira是常见的硝化细菌，二者参与硝化作用，其在2个装置的阴极与阳极均有发现，但Nitrospira在闭路运行模式的CW-MFC阴极丰度最高。由此说明，在装置阳极与阴极均有硝化作用发生，但装置阴极发生的硝化作用更强，而装置阳极发生硝化作用的原因可能是由于进水中含有一定的溶解氧。Desulfuromonas在参与硫的转化中同样会产生电子，高丰度的Desulfuromonas可能会使SMX中的S=O化学键断裂，从而提高抗生素去除率^[34]。因此，闭路运行模式下CW-MFC更高的产电性能和抗生素去除效率可能与其更高的Desulfuromonas相对丰度有关。2个装置的阴极的主要菌属为地杆菌属(Geobater)、固氮弧菌属(Azoarcus)、Sulfuritalea、Nitrospira等菌属。Azoarcus是CW-MFCs系统阴极相对丰度最高的菌属，这是一种广泛存在于自然界中的兼性厌氧菌，是参与污水中的$ {\rm{N}}{{\rm{O}}_3}^ - $去除的重要成员^[35]。闭路运行模式下CW-MFC中Azoarcus相对丰度为8.34%，显著高于开路运行模式的5.26%(P<0.05)，这可能是其有更好脱氮效率的原因之一。值得注意的是，对全部细菌属数据进行分析时发现，虽然已知的厌氧氨氧化菌属的相对丰度在闭路运行的CW-MFC阳极高于开路运行的CW-MFC阳极，与Planctomycetes结果相一致，但均未达到细菌属前30的水平，硝化反硝化仍是脱氮的主要途径。整体上来看，CW-MFC系统阳极与阴极微生物在群落组成上有显著的差异，不同的运行模式显著影响了细菌在属水平上的结构组成。

分别选取阳极与阴极已归类的相对丰度前5的细菌属和$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $-N、$ {\rm{N}}{{\rm{O}}^ -_3} $-N、TN、COD、SMX及CIPH的去除性能进行RDA分析，以探讨微生物群落与污染物去除之间的关系。图5(a)为阳极和阴极优势菌属与氮去除率之间的冗余分析结果。结果表明，$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $-N与TN的去除率随着阴极的5个细菌属以及阳极4个细菌属丰度的升高而升高，随着阳极的Methylotenera丰度的升高而降低。而$ {\rm{N}}{{\rm{O}}^ -_3} $-N的去除率则相反，随着大多数细菌属丰度的升高而降低，仅随着阳极的Methylotenera丰度的升高而升高。$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $-N和TN与优势菌属之间的关系进一步证明了微生物是CW-MFC脱氮的主要途径，微生物群落结构是影响脱氮的因素之一。有研究^[16]表明，$ {\rm{N}}{{\rm{O}}^ -_3} $-N的去除与高的微生物丰度紧密相关。据此可以推测，本研究中$ {\rm{N}}{{\rm{O}}^ -_3} $-N去除受$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $-N硝化作用转化影响更大。图5(b)为阳极和阴极优势菌属与出水耗氧有机物(以COD计)及抗生素质量浓度之间的冗余分析结果。结果表明，出水COD与2种目标抗生素CIPH、SMX浓度随着阳极Methylotenera丰度的升高而升高，而随着其他阳极和阴极的细菌属丰度的升高而降低，即COD、CIPH和SMX的去除率随着绝大部分细菌属的升高而升高，这与$ {\rm{N}}{{\rm{H}}^ +_4} $-N与TN的去除结果一致。同时，在图5(a)和图5(b)中，闭路运行的CW-MFC中绝大部分细菌属的相对丰度更高。RDA分析结果表明，开闭路运行模式显著影响了CW-MFC的细菌群落组成，在氮素与抗生素的去除方面起着关键性作用。

1) CW-MFC系统对氮及有机物等污染物有良好的去除性能，闭路运行模式对$ {\rm{N}}{{\rm{H}}_4}^ + $、TN及COD有更好的处理效果。

2)闭路运行与开路运行的CW-MFC系统均能够有效去除污水中的抗生素，去除率大于99%。闭路运行的CW-MFC去除效果更好。

3)闭路运行模式会提高微生物丰富度与多样性，同时会对微生物群落结构产生影响，从而影响废水中污染物的去除能力。